[发明专利]利用SSR引物鉴定大麦品种的方法及其应用

权利要求书

1.  一种利用SSR引物鉴定大麦品种的方法，包括提取供试品种样品的DNA、用SSR引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行凝胶电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染，SSR谱带分析，其特征在于：所述的供试品种样品至少为两个大麦品种，所述的SSR引物包括14对基本核心SSR引物和14对扩展核心SSR引物，其中，14对基本核心SSR引物为Bmag0211 、Bmag0378、Bmag0711、Bmac0209、Bmag0877、EBmac0701、EBmac0635、Bmag0353、Scssr10148、Scssr03907、Bmag0009、Bmag0867、HVCMA和EBmac0603对应的引物，14对扩展核心SSR引物为Scssr02748、HVM54、Scssr07759、HvXan、HVM27、HVM60、HVM40、Bmac0181、Scssr07106、Bmag0387、Bmac0018、Scssr09398、Bmac0064和Scssr15864对应的引物；具体步骤如下：

提取供试品种样品的DNA；

用14对基本核心SSR引物分别对供试品种模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应总体积为25 μL，扩增反应体系为：SuperTaq? 5U/μL的DNA Polymerase  0.2 μL，2.5mmol/L的dNTP 2 μL，含Mg²⁺的10×PCR Buffer 2.5 μL，10 μmol/L的每对引物的上游和下游引物各1μL，供试大麦品种基因组20 ng/μL的DNA模板1 μL，双蒸水补足25μL；PCR反应程序为94℃预变性5min，35个扩增循环，94℃ 30 sec，47～62℃ 30 sec，72℃ 1min，72℃ 延伸5min，4℃保存；

供试大麦品种PCR扩增产物进行凝胶电泳，变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为6%，凝胶组分为：6%变性聚丙烯酰胺溶液60 mL，TEMED 50 μL,10% 过硫酸胺 500 μL；设定功率50 W，1×TBE缓冲液电泳 2 h，关闭电源，进行染色；染色过程是：10%冰醋酸溶液固定20 min，超纯水迅速水洗，0.2%硝酸银溶液银染30 min，超纯水再次迅速水洗，显影液显色数分钟，直至条带清晰，10%冰醋酸溶液终止5 min，超纯水再次水洗；

通过分析基本核心SSR结果，大麦品种间多态性位点的差异，确定等位变异数及多态性信息含量，在相同迁移率位置上进行“1、0”标注，构建大麦品种的SSR分析谱带数据，利用这些数据对来源不明的大麦品种进行比较,如果品种间差异位点数≥3，判定为不同品种，形成鉴定结果；如果品种间差异位点数小于2,则转入e步骤；

再用14个扩展核心SSR引物对采用供试品种模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应总体积和扩增反应体系均与b步骤相同；并按照d步骤进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染；

综合分析基本核心SSR和扩展核心SSR引物的结果，确定等位变异数及多态性信息含量，在相同迁移率位置上进行“1、0”标注，构建大麦品种的SSR分析谱带数据，品种间差异位点数≥3，判定为不同品种；品种间差异位点数为1或2，判定为近似品种；品种间差异位点数为0，判定为疑同品种，形成鉴定结果；

    所述的6%变性聚丙烯酰胺溶液为420g尿素，10×TBE 50 mL，40% PAG 150 mL，去离子水定容至1000 mL；所述的10%冰醋酸溶液是将100 mL冰醋酸，加入1000 mL去离子水；所述的0.2%硝酸银溶液是将2.0 g硝酸银，溶于1000 mL去离子水中；所述的显影液是将15 g 氢氧化钠溶于1000 mL去离子水中，再加入5 mL甲醛。

2.根据权利要求1所述的利用SSR引物鉴定大麦品种的方法，其特征在于：提取供试品种样品的DNA是指：对来源不明的大麦品种进行随机取样，每份样品取单株5株，取幼苗叶片0.5 g混合为一个样本，剪碎，放入2 mL离心管中，往离心管中加入液氮冷冻，放入研磨仪，磨成粉状后立即加入预热的DNA提取液790～810μL，剧烈摇动混匀，并在65℃水浴中保温30～50 min，摇动使其混匀。