[发明专利]一种酮还原酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种酮还原酶基因及其应用。 

背景技术

阿托伐他汀钙(atorvastatin calcium)，商品名立普妥(lipitor)，化学名(3R,5R)-7-[2-(4-氟苯基)-5-异丙基-3-苯基-4-（苯氨基甲酰基）吡咯-1-基]-3,5-二羟基庚酸钙盐，它能够强效抑制羟甲基戊二酰单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的活性，阻断HMG-CoA还原成羟甲戊酸，进而大大降低总胆固醇和低密度脂蛋白的含量，可有效改善动脉粥样硬化，降低血液中的脂蛋白浓度，不仅是治疗高胆固醇血脂症和混合型高血脂症的首选药物，还能有效防治冠心病和脑中风等疾病。由于阿托伐他汀钙具有起效快，降脂作用强，作用时间长等优点，该药一经推出，就取得了很好的销售业绩。 

(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯（分子式为C(CH₃)₃OCOCH₂CH(OH)CH₂CH(OH)CH₂CN，分子量为229.27，CAS号：125971-93-9），带有两个具有手性结构的羟基，是合成阿托伐他汀钙的关键手性中间体，该部分结构也是HMG-CoA还原酶特异性结合的关键部位，其合成方法有多种，常见的方法主要有化学法和生物法两种。与化学法相比，生物法具有反应条件温和：常温、常压、中性或接近中性pH，设备要求不高，投入资金相对较少，且反应转化率高、对映体选择性高等多种优点，更受研究人员和生产企业的青睐。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种酮还原酶基因及其编码的酮还原酶。 

本发明的另一目的是提供含有该基因的载体和基因工程菌。 

本发明的又一目的是提供该酮还原酶基因及其编码的酮还原酶的应用。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现： 

一种酮还原酶基因，序列如SEQ ID NO.1所示。 

本发明所述的酮还原酶基因编码的酮还原酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 

含有本发明所述的酮还原酶基因的重组表达载体，优选将本发明所述的酮还原酶基因插入到Puc18中所得到的重组表达载体。 

一种生产酮还原酶的基因工程菌，其中包含本发明所述的酮还原酶基因。 

所述基因工程菌的宿主细胞优选大肠埃希氏菌（Escherichia coli），进一步优选大肠埃希氏菌BL21(DE3)或大肠埃希氏菌Mc 1061，最优选保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年8月29日，保藏编号为CCTCC M 2012319的基因工程菌BL21（DE3）KRED06。 

一种酮还原酶的制备方法，包括如下步骤：培养本发明所述的生产酮还原酶的基因工程菌，获得重组表达的酮还原酶。 

所述的培养包括摇瓶培养或发酵罐培养。 

其中发酵培养基成分为：酵母膏20g/L，蛋白胨15g/L，NaCl 6g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾11.5g/L，磷酸二氢钾6.5g/L，硫酸铵1.0g/L，硫酸镁七水合物0.6g/L，柠檬酸铁80mg/L，硫酸锌七水合物50mg/L，氯化铜四水合物20mg/L，钼酸铵四水合物50mg/L。 

其中所述发酵罐培养的发酵条件是：DO 30%以上，空气流量1:1.5vvm，葡萄糖残余量1%以下。 

发酵过程采用常规的两阶段控制策略：发酵前期即菌体生长阶段，控制发酵液pH 7.0左右，罐温35-37℃；发酵后期即添加IPTG之后的酮还原酶诱导表达阶段，控制发酵液pH 7.0-7.2左右，罐温为28℃。以使发酵前期菌体大量繁殖，发酵后期卤醇脱卤酶大量表达。 

本发明所述的酮还原酶基因在不对称还原酮类化合物中的应用，通过基因工程手段构建含有权利要求1所述的酮还原酶基因的基因工程菌，表达制备酮还原酶，以所得的酮还原酶为催化剂，不对称还原酮类化合物，以制备光学活性手性醇。 

其中，所述的酮类化合物结构式为： 

其中，R₁为烷基，苯基或带有取代基的苯基，卤素，CN； 

R₂为烷基，苯基或带有取代基的苯基。 

反应方程式如下 

本发明所述的酮还原酶作为催化剂在不对称还原酮类化合物中的应用。