[发明专利]焦磷酸测序法检测FGFR2基因多态性试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体的是涉及焦磷酸测序法检测FGFR2基因多态性的试剂盒及方法。 

背景技术

乳腺癌(Breast Cancer)是来自乳腺终末导管小叶上皮的恶性肿瘤。发病率在过去50年中呈缓慢上升趋势，已跃居女性恶性肿瘤第一位。乳腺癌常发与于40~60岁的妇女，小于35岁得女性较少发病。男性乳腺癌罕见，约占全部乳腺癌的1%左右。乳腺癌多数发生于乳腺外上象限，其次为乳腺中央区和其他象限。乳腺癌的发病机制尚未完全阐明，雌激素长期作用、家族遗传倾向，环境因素和长时间大剂量接触放射线和乳腺癌发病有关。约5~10%的乳腺癌患者有家族遗传倾向。FGFR2是成纤维细胞因子受体家族中的一员，研究发现该基因突变与患乳腺癌易感性显著相关 (Nature. 2007; 447(28): 1087-93) 。 

FGFR2基因在 rs2981582位点突变后，杂合突变（GA）导致一二三级患乳腺癌的风险比野生型（GG）分别增加32%、31%和12%，纯合突变（AA）导致一二三级患乳腺癌的风险比野生型（GG）分别增加83%、68%和32% (Plos Genet. 2008. 4(4): e1000054) 。 

FGFR2基因突变导致乳腺癌发病风险增加，该基因位点的突变检测对乳腺癌的预防，早期诊断和治疗具有重要意义。有乳腺癌、卵巢癌或其它癌症家族史的人群，有乳腺癌良性肿瘤病史者，未生育或35岁以后才生育的人群，月经初潮早，绝经较晚，经期长者，经常摄取高脂肪或高动物性脂肪、爱吃熟牛肉的人群，经常口服避孕药的人群，经常接触各种化学致癌剂、接受各种物理辐射、大量食用腌制食品以及吸烟、酗酒的人群，转移癌症至乳房者，不常运动或易患病人群更应该及早的进行该基因的检测。对于FGFR2基因检测高患病风险的人群，应该在饮食、生活、运动、保健、健康体检等方面进行科学合理的安排，以达到降低乳腺癌患病风险。 

综上，FGFR2基因多态性对乳腺癌疾病的风险评估，尤其是一些特殊人群患病的预测，具有重要的临床意义。开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测FGFR2基因多态性检测试剂盒将为乳腺癌的发生起到预测、预防作用。 

焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。 

发明内容

本发明旨在提供一种焦磷酸测序法检测FGFR2基因（SEQ ID NO.1）多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测FGFR2 SNP。 

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为： 

一种焦磷酸测序法检测FGFR2基因多态性的试剂盒，包括如下引物：

（1）扩增引物：

     上游引物：5’-GAATAAAACGGCAGATCCCA-3’（SEQ ID NO.2）；

     下游引物：5’-ACGAGATGTGTTCCCAGAGC-3’（SEQ ID NO.3）；

     其中，下游引物的5’进行生物素标记；

（2）测序引物：5’-GCCACTTAATGAACCTGT-3’（SEQ ID NO.4）；

试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。

一种应用上述试剂盒检测FGFR2基因多态性的方法，包括如下步骤： 

（1）DNA提取；

（2）聚合酶链反应：

配制50μl PCR扩增体系，包含：10×PCR buffer 5.0μl， dNTP 1.5μl， FGFR2-上游引物 0.5μl， FGFR2 (RS2981582)下游引物0.5μl， rTaq0.5μl，水41.0μl，模板1.0μl；循环程序为：95 ^oC 5min预变性；依次在95^oC 30S，50^oC 30S，72^oC 30S，进行40个循环；72^oC 保持5min，最终保持在4 ^oC，得扩增产物；

（3）焦磷酸测序单链样本纯化；