[发明专利]表达小鼠神经生长因子的重组腺病毒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药卫生领域，旨在提供一种携带小鼠神经生长因子（nerve growth factor, NGF）的重组腺病毒及其制备方法，为进一步研究神经生长因子的基因治疗奠定基础。

背景技术

冠心病和糖尿病往往相互伴随，冠心病患者中60%-80%存在血糖升高，糖尿病患者80%死于冠心病，糖尿病合并冠心病对糖尿病患者的健康构成了极大的威胁。糖尿病容易合并冠心病、心肌缺血的机制与糖尿病神经末梢病变有关。国内王利宏等报道感觉神经末梢大量分布于心血管系统，包括许多血管的外膜和心脏。Bolli等的研究表明感觉神经参与心肌缺血时机体的保护过程。糖尿病患者由于神经末梢受损，容易并发严重的心肌缺血。TRPV1受体是位于感觉神经末梢上的感受器，在心脏有大量的表达。国内王利宏等研究显示糖尿病小鼠心脏上TRPV1受体及其神经递质CGRP、SP的表达合成明显减少，而Zhong B等的研究表明激活TRPV1受体能改善小鼠心肌缺血再灌注后的心脏功能。

神经生长因子是一种多肽物质，主要存在于交感神经元及部分感觉神经元所分布的靶区域内的细胞组织内，其生物学活性主要是维持交感神经和感觉神经的功能。能诱导神经递质的合成，蛋白磷酸化、甲基化以及类似ras--蛋白的基因表达所需酶的合成，能有选择地营养交感神经节神经元和周围神经系统的小纤维感觉神经元，改善神经末梢功能。是目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。

随着分子生物学的不断发展，加上计算机技术的引入，使得目的基因的靶向导入治疗成为可能。本发明通过神经生长因子目的基因获取、重组质粒的构建及阳性克隆测序，成功构建了过表达腺病毒载体，并通过重组质粒转染293T细胞后免疫荧光观察及免疫印迹（Western Blot）检测，及重组腺病毒滴度测定，得到了合适滴度的有表达功能的重组腺病毒载体。

发明内容  

本发明的目的是提供表达小鼠神经生长因子的重组腺病毒载体的构建，通过以下步骤实现：

（1）重组质粒的构建

查询美国国立生物技术信息中心获得小鼠神经生长因子NGF 的基因序列，序列号NM_001112698，（编码序列SEQ ID NO:1），获取cDNA模板及引物。PCR法扩增目的基因:神经生长因子（NGF）。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测有无目的基因。从上海吉凯基因化学技术有限公司处购得腺病毒载体（GV135），将腺病毒载体(GV135)用限制性内切酶AgeI酶切（酶切位点为5＇A＾CCGGT3＇），获得线性化表达载体。通过引物1 GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTCCATGTTGTTCTACACTC 和引物2 TCACCATGGTGGCGACCGGGCCTCTTCTTGTAGCCTTC，在PCR产物两端引入GV135载体的一段交换臂，由于重组酶的作用PCR产物和载体在交换臂处进行交换连接，连接后，以氯化钙沉淀法转化大肠杆菌DH5α，接种于含有氨苄抗性的琼脂平皿，挑选阳性菌落，用小量质粒提取试剂盒提取质粒。而后1.2%琼脂糖凝胶电泳，鉴定阳性克隆，并对阳性质粒进行测序。

（2）重组腺病毒的包装产生

将购于上海吉凯基因化学技术有限公司的293T细胞接种于培养板内，每60mm的培养板中接种7–8 × 10⁵个细胞，培养至细胞密度达70%时转染。取5μg上述已制备的过表达重组质粒，加入25μl的CaCl₂ 、250μl的N,N-二(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸BES缓冲液，混匀后室温孵育10分钟，逐滴加入60mm的培养板中，混匀后将培养板放入37℃ 5%CO₂的孵箱中培养。转染8天后，观察到大部分细胞浮起，细胞变大变圆，胞核增大，即进行细胞收集。产生重组腺病毒载体，其编码序列为SEQ ID NO:2。

所述PCR法中使用了两种引物，

PCR引物1: GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTCCATGTTGTTCTACACTC ，引物2: TCACCATGGTGGCGACCGGGCCTCTTCTTGTAGCCTTC，引物3：GGTATAAGAGGCGCGACCAG，引物4：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG，其中引物1和引物2作为目的基因NGF的反应引物，引物3和引物4作为重组克隆的PCR鉴定引物。

本发明的第二个目的是提供所述的载体的表达方法，通过以下步骤实现：