[发明专利]绵羊皮肤组织中内参基因的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及基因的筛选方法。

背景技术

随着对不同物种全基因组序列的揭晓，基因的定量表达水平研究在生命科学领域日趋显得重要了。RT-PCR技术作为一种高效的定量PCR技术，可以实现对某个基因进行实时监测，监测其在不同组织、细胞、个体以及不同发育阶段或经过某种特殊条件处理后的表达水平。为了去除不同样本在RNA的产量、质量、逆转录效率以及移液器上可能存在的差异而获得目标基因特异性表达的真正差异，通常选择特定的内参基因进行标准化校正。内参基因扩增中的变化能反映RNA产量、质量和/或cDNA合成效率的变化。因此，为减少样本间的差异选择适当的内参基因是必要的(wong等，2005；Nolan等，2006；Vandesom等，2002)。理想的内参基因应该表达量适中，不存在假基因，在不同的细胞、组织中其无显著性表达量差异，并且其不受任何实验处理措施的影响而体现在表达水平与目标基因相似(陈凤花等，2005)。

放之四海而皆准的内参基因是不存在的，因此，必须在特定的实验条件下检测多种内参基因的稳定性，从而筛选出符合实验特定条件的理想内参(Thellin等，1999；Sturzenbaum等，2001)。有研究报道，定量PCR采取单一的内参校正与标准化目标基因的表达的研究达到了90％以上^[69](suzuki等，2000；vandesompel等，2002)其还阐明仅使用单个内参的方法，可能使得实验表达数据产生二十倍甚至以上的误差，盲目地使用一个持家基因作内参，不但可能难以发现目标基因的微小差异表达，甚至可能得出错误的悖论。根据Thellin等^[70]，(1999)，vandesompele等，(2002)，Brinor等，(2006)和PeterSeta^[71](2007)等的研究表明：至少要使用两个及其以上内参基因才能对定量PCR进行准确的校正。因此，用于评估内参基因稳定性的统计分析软件geNorm(Vandesompele等，2002)应运而生。

目前，常用的内参基因有GAPDH、ACTB、18SrRNA、B2M、TBP、RPL13A等基因。目前，对于中国美利奴羊(新疆型)GAPDH基因作为皮肤组织的内参基因研究还未见报道。

发明内容

本发明提供一种绵羊皮肤组织中内参基因的筛选方法，本发明解决了目前还没有对中国美利奴羊(新疆型)GAPDH基因作为皮肤组织内参基因筛选方法的问题。

为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：绵羊皮肤组织中内参基因的筛选方法，包括以下步骤：

一、确定内参基因的方法：以绵羊皮肤组织为试验样品，首先，取10-20mg皮肤组织组织液氮中彻底研磨，RNA提取试剂盒对皮肤组织样进行总RNA提取，1％琼脂糖凝胶电泳，0.5×TBE电泳缓冲液，100V，15min来检测RNA完整性；

二、取一定量的RNA提取物，用ddH2O稀释2-10倍，用ddH2O将分光光度计调零，取稀释液进行测定RNA纯度，取OD260/OD280读数在1.8-2.0之间的RNA样品进行后续试验，计算RNA终浓度(ng/μL)＝(OD260)×(稀释倍数n)×40；

三、其次，取50ng/μL的RNA样品作为模板，采用cDNA合成试剂盒进行反转录合成cDNA，参考GenBank中绵羊相应基因的核苷酸序列，分别设计并合成18S rRNA、β-Actin、GAPDH、B2M、RPL13A、TBP这6个内参基因的引物；

四、再次，以反转录合成cDNA为模板，分别以6个内参基因为引物，采用SYBR Green I荧光染料试剂盒，进行优化条件的实时荧光定量PCR，每个分析对象均取3次重复实验数据的平均值，每次实验用ddH₂O作为阴性对照，读取实时荧光定量PCR仪系统检测的每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数，即Ct值；

五、最后，采用geNorm程序计算6个内参基因标准化因子Vn/n+1的配对差异分析从而判定最适内参基因的数目，同时，统计分析各内参基因的表达稳定度平均值，即M值，并对其进行排序，M值越小，基因表达越稳定，最终筛选出在绵羊皮肤组织中表达最稳定的内参基因是18S rRNA、β-Actin、GAPDH三个内参基因。