[发明专利]以鸭病毒性肠炎病毒疫苗株为载体的重组病毒疫苗在鸡形目禽类中的应用

说明书

技术领域

本发明属于重组病毒疫苗领域，更具体地属于重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗领域。本发明提供一种可以在鸡形目禽类中使用的活病毒载体，即鸭病毒性肠炎病毒(DEV)弱毒疫苗株载体，其可以表达鸡形目禽类病原的相关基因，并能携带此外源基因在鸡形目禽类中表达，在免疫动物体内诱导良好的针对此病原的保护。本研究分别以表达禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株(其保藏编号为CCTCC V201125，命名为rDEVus78Ha-Re6)和表达新城疫病毒F基因的重组鸭病毒性肠炎病毒疫苗株(其保藏编号为CCTCC V201220，命名为rDEV F)为模式病毒，证明了DEV弱毒疫苗株的以上特性。 

背景技术

鸭肠炎病毒(duck enteritis virus，DEV)，又称鸭病毒性肠炎病毒。能引起鸭、鹅和其它雁形目禽类发生急性、热性、败血性为特征的烈性传染病。但对DEV的研究相对于其它疱疹病毒而言相对比较少。故第八次国际病毒学分类委员会报告将其分类为疱疹病毒^[1]，而未能进一步将其进行分类。2009年，Li等报道了DEV疫苗株全基因组的测序和分析结果，其基因组大小约为158Kb，约编码78个蛋白。通过对DEV疫苗株基因组基因构成及结构分析，DEV被认为是α疱疹病亚科中的中间型病毒，与水痘病毒属成员更为相近^[2]。而同为禽类疱疹病毒的马立克病毒(MDV)和火鸡疱疹病毒(HTV)属于马立克病毒属，鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鹦鹉疱疹病毒(PsHV)为传染性喉气管炎病毒属。 

目前，我国使用的DEV弱毒疫苗株是上世纪60年代在鸡胚联系传代研制成功。只用于预防鸭等雁形目禽类DEV。使用广泛，安全有效^[3]。至今未见有报道其可作为活病毒载体表达鸡等鸡形目禽类传染病病源保 护性抗原，并可用于预防鸡形目禽类传染病。 

自上世纪80年代成功利用痘苗病毒为载体表达单纯疱疹病毒的TK基因以来，人们开始尝试用各种不同DNA病毒为载体，表达不同外源基因，并将构建的重组疫苗用于人和各种不同动物疾病的预防。大量的研究结果表明，疱疹病毒因其基因组大，可供外源基因插入或替代的非必需基因多，被认为是一种良好的构建重组活疫苗的病毒载体。截止目前，已有大量的相关研究报道。在常见畜禽疱疹病毒疾病中，如以伪狂犬病毒(PRV)为载体，分别在gD、gE、gG和TK等基因中插入CSF的E2等外源基因，并用其免疫猪，取得了良好的免疫效果^[5-11]。用在鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的UL0和UL50中分别插入不同HA基因构建成功的重组病毒免疫鸡，均效果良好^[12-14]。同样，Sakaguchi M(1993；1994)和Sonoda K(1996)等分别在MDV1的US10、US3、IRL中插入Lac Z基因，用其免疫1日龄无特定病原鸡(SPF鸡)，1周后用vMDV、vvMDV攻毒，其对SPF鸡的保护效率为80～100％^[15-17]；在MDV1的US10中插入NDV F基因、在US2中插入IBDV VP2基因的重组病毒对MDV强毒的保护效率与对照MDV1相当^[18，19]；Tsukamoto K等(2002)以Pec作为传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因的启动子插入火鸡疱疹病毒(HVT)的UL45和UL46基因之间成功构建重组病毒，用其免疫的SPF鸡足以抵抗IBDV强毒的攻击^[20]。 

本研究室在前期研究中，在鸭病毒性肠炎病毒的基因组中鉴定出可供外源基因稳定插入的复制非必需区。在此基础之上，本研究将目前中国用于禽流感预防的疫苗株血凝素(HA)基因插入DEV基因组的US7和US8基因之间，用其免疫无特定病原鸭(SPF鸭)能使SPF鸭产生良好的对抗流感的抗体^[21]。进一步研究发现，用其免疫鸡，可以诱导良好的HI抗体。攻毒试验表明，免疫后两周，免疫鸡均完全保护。证明DEV弱毒疫苗株能在鸡体内进行一过性复制，并能携带外源基因并表达，使外源蛋白诱导良好的抗体。 

发明内容