[发明专利]一种二维超分辨显微方法和装置

说明书

技术领域

本发明涉及光学显微领域，尤其涉及一种二维超分辨显微方法和装置。

背景技术

由阿贝衍射极限理论可知，常规远场光学显微镜的极限分辨率可表示为其中λ为所用照明光的波长，NA为所用显微物镜的数值孔径。因此，在可见光波段，光学显微镜的分辨率被限制在200纳米左右。然而，随着生物医学技术的发展，研究人员们已经开始对生物组织和细胞在纳米尺度上进行分析，所以必须有一种技术可以突破常规衍射极限的限制，实现超分辨显微。

近年来，多种超分辨显微方法陆续被提出，包括：

受激发射损耗显微术(STED：Stimulated Emission Depletion Microscopy)：利用荧光饱和与激发态荧光受激损耗的非线性关系，并通过限制受激辐射衰减的区域，减少荧光光斑大小，获得小于衍射极限的发光点来提高系统分辨率，从而突破远场光学显微术的衍射极限分辨力限制来实现无接触三维成像；

结构光照明显微术(SIM：Structured Illumination Microscopy)：将多重相互衍射的光束照射到样品上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨率的信息，通过衍射放大作用，得到清晰的超分辨图像；

光激活定位显微术(PALM：Photoactivated localization Microscopy)：采用光敏蛋白质标记样品，并且用超低光强的激活光使得每次只有极少数的光敏蛋白质被敏化，因此只有极少数的光敏蛋白被激发发射荧光。记录单个荧光分子所发出的光子直至漂白并通过PSF数字化计算出中心位置。反复这一过程逐个获取样品上所有荧光分子的中心位置，最后叠加重构成一幅完整的图像。

以及随机光场重建显微术(STORM：Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)：与PALM基本原理类似，利用荧光分子的随机逐个激发发射荧光光子，通过PSF的数字化获得其中心位置。

以上几种方法均已被实验证明可以在远场实现超衍射极限的空间分辨率，但是各自都还存在着不足。STED和SIM对系统设备的要求很高，系统的造价非常昂贵；STORM和PALM的成像速度还比较慢，无法满足实时检测的需求。

发明内容

本发明提供了一种二维超分辨显微方法和装置，可以在远场实现超衍射极限的横向分辨率。该种方法和装置具有成像速度快、装置简单、信噪比好等特点，可以很好地应用于荧光及非荧光样品的检测之中。

一种二维超分辨显微方法，包括以下步骤：

1)开启第一光源，并关闭第二光源、第三光源和第四光源，所述第一光源发出的工作光束转换为线偏振光后对待测样品进行扫描，收集扫描点发出的信号光并得到第一信号光强I₁(x，y)，其中x，y为扫描点的二维坐标；

2)开启第二光源，并关闭第一光源、第三光源和第四光源，所述第二光源发出的工作光束转换为线偏振光后对待测样品进行扫描，收集扫描点发出的信号光并得到第二信号光强I₂(x，y)，其中x，y为扫描点的二维坐标；

3)开启第三光源，并关闭第一光源、第二光源和第四光源，所述第三光源发出的工作光束转换为线偏振光后进行相位调制，并对待测样品进行扫描，收集扫描点发出的信号光并得到第三信号光强I₃(x，y)，其中x，y为扫描点的二维坐标；

4)开启第四光源，并关闭第一光源、第二光源和第三光源，所述第四光源发出的工作光束转换为线偏振光后进行相位调制，并对待测样品进行扫描，收集扫描点发出的信号光并得到第四信号光强I₄(x，y)，其中x，y为扫描点的二维坐标；

5)根据公式I_e1(x，y)＝I₁(x，y)-γI₃(x，y)计算得到第一差分光强，根据公式I_e2(x，y)＝I₂(x，y)-γI₄(x，y)计算得到第二差分光强，最终利用I(x，y)＝min{I_e1(x，y)，I_e2(x，y)}计算有效信号光强I(x，y)，并利用I(x，y)得到超分辨图像，其中γ为差分系数。

当待测样品为荧光样品时，所述信号光为所述照明光斑在样品上激发出的荧光；当待测样品为非荧光样品时，所述信号光为所述照明光斑经样品表面反射的光束。

所述步骤3)中的相位调制函数为；