[发明专利]丙型肝炎病毒荧光定量PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种快速定量检测血清、血浆中的丙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测试剂盒。

背景技术

丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）是一种有包膜的单股正链RNA病毒，属于黄病毒科丙型肝炎病毒属，呈球形，直径小于80mm，其基因组总长约9.6kb，包含一开放的阅读框（ORF），后者经翻译成一个大的多蛋白前体（约3000个氨基酸)，并在翻译的同时和翻译后由宿主细胞的信号肽酶和HCV自身编码的蛋白酶加工成约10个成熟的HCV蛋白（包括结构蛋白及非结构蛋白）。全球丙型肝炎的感染率为3％，估计约有1.7~2.0亿人感染HCV，HCV感染可导致慢性丙型肝炎、肝硬化及肝癌的发生。随着分子生物学与流行病学的发展，国内外研究已证实，丙型肝炎是肝细胞肝癌（Hapatitis C carcinoma，HCC）的重要病因，其中约有50%~80%急性感染者转变为慢性，进而发展为肝硬化和肝细胞性肝癌，成为威胁人类健康的重要因素。在我国一般人群抗HCV阳性率为3.2％，丙型肝炎患者约4000万，即每30个人中就有一名丙肝患者。

丙型肝炎是一种严重危害人体健康的传染病，目前尚无有效的治疗措施，因此，早期发现丙型肝炎患者、及时治疗已成为阻断丙型肝炎传播的重要手段。血清HCV RNA阳性是HCV感染的直接依据，HCV RNA载量反映了病毒复制的活跃程度和患者病程变化，一般在HCV感染后2~5周的血清中即可检出，是丙型肝炎的诊断和衡量抗病毒疗效的重要指标。我国目前应用的HCV RNA检测主要以国产试剂盒为主，其最低检测值为l×10³IU/ml，与同类进口试剂盒相比，敏感性过低，给准确判定临床治疗效果带来一定影响。因此，研究检测HCV RNA的载量具有重要的理论价值及临床意义。

目前最常见的HCV基因检测方法主要有定量逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）和分支DNA检测（branched DNA，bDNA）。

RT—PCR检测血清中的HCV RNA，基本原理是首先经逆转录酶作用，在特异性引物存在下，将HCV RNA逆转录为单链的CDNA，再通过PCR将CDNA扩增，电泳后确证结果。此法可以扩增极微量HCV RNA，具有早期、敏感和特异等特点；它的引物均根据HCV基因5’端保守区域设计，但是由于引物选择的位置及方法学上的差异HCV RNA的检测结果出入较大，往往无法应用于大规模的人群筛检，常出现假阳性或假阴性的结果，且费时，检出率较低，难以在常规工作或基层实验室推广普及应用。

bDNA是一种核酸检测技术，属于信号扩增，是把HCV基因组通过特异性“捕获”探针固定在微孔板上，带有bDNA多聚物的病毒特异性延伸探针与固定的病毒核酸结合，bDNA多聚物上带有寡核苷酸的重复结合位点，结合的寡核苷酸偶联的酶催化荧光底物产生荧光信号，测定信号的强弱判断样品中HCVRNA的量。检测限为615IU/ml，特异性达到96.0%-98.8%，降低了污染机会，具有较高的重复性，但敏感性不高。

此外，利用分子杂交直接检测HCV RNA也是一种较为特异敏感的方法，但不如PCR法灵敏，且操作繁琐，即采用与HCV RNA互补的cDNA探针进行斑点杂交来直接检测血浆中的HCV RNA。基因芯片技术检测HCV RNA：由于该技术较为复杂，且成本较高，目前对其应用仍大多停留在实验阶段，离临床检验及疾病诊断的普及性还有一段距离。

最新出现的实时荧光定量PCR把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，借助于荧光信号检测PCR产物，解决了传统PCR技术不能定量和扩增产物污染的问题，避免了普通定量PCR操作过程中的污染，使其操作简便、快捷，结果准确，已成为基因表达定量的强有力的工具，具有敏感性和特异性高、重复性好及定量范围广等特点。定量检测要求检测方法敏感、特异、准确、精确、重复性好、线性范围广，且在各个基因型之间无差异。RT—PCR和bDNA技术，均无法像荧光定量PCR那样基本上满足上述所有的条件。与荧光定量PCR相比，这两种检测方法的敏感性低，且线性范围窄。而全自动的荧光定量PCR因其更优异的准确性、精确度和可重复性，成为最有前景的定量检测技术。