[发明专利]重组融合蛋白PTD-HSP27及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体设计及重组融合蛋白技术领域，尤其涉及一种重组融合蛋白PTD-HSP27及其应用。

背景技术

白内障是发生在眼球内晶状体上的一种疾病，是最常见的致盲和视力残疾的原因。分析探讨白内障的发展过程和发病机制，开发出有效的预防和治疗白内障的药物具有重要的社会效益。已有研究证实细胞凋亡在空间和时间上要早于白内障的发生，推断晶状体上皮细胞凋亡可能是各种白内障发生的共同细胞学基础。细胞凋亡机制认为如果上皮细胞出现凋亡，晶状体生长就会停滞，晶状体上皮细胞（LEC）出现脱落，从而导致细胞膜通透性增加等一系列改变，晶状体稳定性受到破坏，最终导致白内障的发生。

热休克蛋白是生物体或离体培养细胞在不良环境因素作用下所产生的一组具有高度保守性的应激蛋白，在细胞保护中具有重要的作用。热休克蛋白27（Heat Shock Protein 27，HSP27），是HSP家族中sHSP亚家族中的一员，可以与部分展开或与非天然的蛋白质结合，能够抑制细胞的凋亡，保护组织细胞免受进一步的变性。大量的研究证实小分子的HSP27可通过抑制线粒体释放细胞色素C以及直接与细胞色素C、Caspase-3前体结合而抑制细胞凋亡。研究发现，转基因小鼠的心肌出现缺血再灌注损伤时，心肌细胞大量表达HSP27防止细胞发生凋亡和坏死。由此可以推测细胞内HSP27含量的增加可以抑制细胞的凋亡。

PTD（Protein transduction domain）是最初发现于HIV病毒TAT 蛋白中的具有穿膜功能的核心区；由11个氨基酸YGRKKRRQRRR组成，含有8个碱性氨基酸，生理条件下带较高的正电荷，并形成稳定的α螺旋结构。PTD具有强大的运载潜能，能将外源性蛋白质、DNA、RNA、化学药物等转运至细胞内，甚至可以穿越血脑屏障。此过程不受化合物／复合物分子类型和大小的限制，并且对宿主细胞没有显著毒副作用。

一般情况下，HSP27只能通过细胞应激状态下的自行产生而发挥其分子伴侣等功用。本发明利用基因工程原理和技术实现重组的HSP27和PTD融合的新型融合蛋白PTD-HSP27的制备，首次将其应用于人眼晶状体上皮细胞，对其生物学功能进行研究。并证实PTD-HSP27既有HSP27的功能活性，又能跨细胞屏障运输，穿过角膜各层细胞进入眼内。此项特性使PTD-HSP27可通过房水循环作用于眼内各类细胞，这一特点使其用药途径获得优化，应用范围得以扩展。

目前尚未有人利用PTD的运载功能将HSP27运送进入眼内，利用PTD-HSP27作用于眼部的各类细胞，从而实现例如延缓白内障等眼部疾病的发生发展，未见有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种既可通过角膜屏障和跨膜运输，又具备HSP27生物活性的重组融合蛋白PTD-HSP27。

本发明的另一个目的是提供上述重组融合蛋白PTD-HSP27在制备预防和治疗细胞凋亡相关眼部疾病的药物中的应用。

本发明的上述目的通过如下方案予以实现：

本发明的重组融合蛋白PTD-HSP27，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

一种编码上述重组蛋白PTD-HSP27的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明的重组蛋白PTD-HSP27能用于预防或治疗细胞凋亡相关眼部疾病，特别是PTD-HSP27可较易穿过角膜的细胞屏障，跨膜运输进入晶状体上皮细胞，抑制晶状体上皮细胞的凋亡，极大的缓解白内障的发生和发展。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.细胞水平研究发现，本发明的重组融合蛋白PTD-HSP27具有减少人晶状体上皮细胞凋亡的功能，说明PTD-HSP27具有HSP27的活性。

2. 本发明中PTD-HSP27既具有HSP27的生物学活性，又因含有PTD而具备跨生物屏障运输的功能，能有效穿过角膜组织进入房水，从而可对眼内各类细胞发挥功用。

3.本发明中应用的重组融合蛋白PTD-HSP27为穿角膜施药等方面都提供了研究基础，而且鉴于该重组融合蛋白PTD-HSP27既有HSP27的活性，又能跨角膜运输，可改善其用药途径及扩大其应用范围。

附图说明

图1重组融合蛋白PTD-HSP27电泳图。

图2为重组融合蛋白PTD-HSP27穿LEC细胞膜进入细胞；A为相差显微镜下的LEC细胞，B为荧光显微镜下的标记蛋白PTD-HSP27的荧光分布，C为图A、B叠加，显示为PTD-HSP27蛋白位于LEC细胞内，提示PTD-HSP27可进入LEC细胞。