[发明专利]一种耐高温阿拉伯多糖酶及其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术及生物质精炼技术领域，具体涉及一种耐高温阿拉伯多糖酶及其编码基因和应用。

背景技术

阿拉伯多糖是L-阿拉伯糖以α-1,5-糖苷键连接组成的的中性多糖。它们通常聚合度较低（40-50），辅以α-1,3或少量的α-1,2糖苷键相连的分支结构，能从花生、苹果和甜菜等植物组织中分离获得。阿拉伯多糖酶是半纤维素降解酶系中的一种多糖水解酶，通过随机切阿拉伯多糖的α-1,5-糖苷键，将阿拉伯多糖水解为L-阿拉伯糖。临床研究表明，L-阿拉伯糖对蔗糖的代谢转化具有阻断作用，因此在减肥、控制糖尿病等方面具有重要应用前景。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种耐高温阿拉伯多糖酶，以使其满足使用要求。本发明的另一目的是提供一种编码上述耐高温阿拉伯多糖酶的核苷酸序列。本发明还有一目的是提供上述一种耐高温阿拉伯多糖酶的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种耐高温阿拉伯多糖酶，氨基酸序列如SEQ NO：1所示。

一种耐高温阿拉伯多糖酶，其特征在于：氨基酸序列为权利要求1所述的SEQ NO：1序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有阿拉伯多糖酶活性的衍生蛋白质。

一种编码耐高温阿拉伯多糖酶的基因， DNA序列如SEQ NO：2所示。

一种可表达耐高温阿拉伯多糖酶的重组载体，在所述的重组载体上克隆有如SEQ NO：2所示的DNA序列。

一种可表达耐高温阿拉伯多糖酶的重组菌，在所述的重组菌内克隆有如SEQ NO：2所示的DNA序列。

一种扩增编码耐高温阿拉伯多糖酶的基因的方法，所使用的引物对为：Tth-1：5’-GGAATTCCATATGGTATTCAACTGGGCAACTGTACAC-3’；Tth-2：5’-CCGCTCGAGATCTTCGATCCGAACTCCCCAG-3’。

所述的耐高温阿拉伯多糖酶在酶解阿拉伯多糖中的应用。酶解反应温度为60~85℃，pH为6.0~8.0的反应体系。

耐高温阿拉伯多糖酶在降解水果蔬菜和纤维原料中的应用。

上述的重组载体或重组菌在酶解阿拉伯多糖中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明所提供的阿拉伯多糖酶具有极强的耐热性能和偏中性pH条件下高活性的特性。在75℃、pH为6.5的条件下酶活性最高，比酶活达到16.7 U/mg；该蛋白酶在温度为60℃-85℃、pH为6.0-8.0的范围内，均具有较高的酶活，在75℃的反应体系中，保温2h 酶活性保持不变。这些特性使得本发明得到的阿拉伯多糖酶比现有阿拉伯多糖酶具有更大的优越性，适用于75℃以上高温、偏中性pH条件下水果、蔬菜及半纤维素中阿拉伯多糖的降解，具有潜在的工业应用价值。

附图说明

图1是Tth arase蛋白的SDS-PAGE图；

图2是Tth arase蛋白的最适温度结果图；

图3是Tth arase蛋白的最适pH结果图；

图4是Tth arase蛋白的热稳定性结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1  嗜热陆地热泉高温神袍菌基因组DNA的提取

取嗜热陆地热泉高温神袍菌Thermotoga thermarum DSM5069（购自德国微生物菌种保藏中心）新鲜菌体10g，悬于5mL 50mM Tris缓冲溶液中（pH8.0），混匀后，在37℃放置20min，然后加入2mL 10%SDS，55℃放置5min，用等体积的酚-氯仿（24:1）抽提一次，取上清液加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃放置30 min，4℃ 13000rpm离心20min，收集沉淀。沉淀溶于0.5mL TE缓冲液（pH8.0，10mM Tris，1mM EDTA），加入10mg/mL RNase 3μL，37℃保温1h，用等体积的酚-氯仿（24:1）抽提一次，取上清加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃放置30min，4℃ 13000 rpm离心20min，收集沉淀，真空冷冻干燥，用0.5mL超纯水溶解，备用。

实施例2  阿拉伯糖基因Tth arase的制备

可采用如下方法制备Tth arase基因，也可以采用人工合成的方式得到。