[发明专利]一种胞外生产重组β-环状糊精转移酶的生产方法

说明书

技术领域

     

本发明属于发酵工程技术领域，具体来说是用培养重组大肠杆菌生产β-环状糊精葡萄糖基转移酶（β-CGT酶）的生产方法。

背景技术

环状糊精葡萄糖基转移酶（简称CGT酶）是一种能够通过分子内转移糖基反应转化淀粉及相关基质合成环糊精（CDs）的胞外酶，根据生成的主要产物可大致分为α-、β-、γ- 三种类型。环状糊精一般分类为α-、β-、γ-、δ-、ε-、ζ- 及η-CD，分别由6、7、8、9、10、11及12个葡萄糖单元组成，其中研究最多且应用最广的是α-、β-、γ-CD。目前β-CD的应用最广泛，这是由于β-CD的孔径适中，性质稳定。β-环糊精是一种具有内疏水外亲水的筒状结构，能和许多疏水客体化合物或功能基团包结在其环形疏水空隙内，从而改变了客体物质的物理、化学或生物学性质，以此特性为基础衍生出环糊精的包埋、包合技术，致使其在轻工、农业、化工、环保、食品领域尤其是作为食品添加剂方面应用性很广。因此大规模生产β-CD有重要的意义。

现有的生产β-CD的主要方法是酶生产法，想要提高β-CD的产率、降低制作成本，必须大幅度的提高β-CGT酶的产率，目前国外对β-CGT酶的研究较多，国内关于这方面的研究不太成熟，主要包括筛选和诱变野生菌种、产酶发酵条件优化等，基因工程菌的研究不多。国内能够生产β-CD不多，生产的β-CGT酶只能自给自足，且相比日本、德国、法国等国家产量不高，价格较贵且纯度不高，国内环糊精的供需也多依靠进口。

产β-CGT酶的微生物种类很多，现在工业上生产环糊精所用的CGT酶大都来自芽孢杆菌属，但此类菌产CGT酶的能力非常低，不能满足环糊精的制备需求。为了解决野生菌种产CGT酶能力较低这个问题，运用基因工程将有关CGT酶基因在其他宿主菌种表达成为如今研究开发的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效胞外表达β-环绕糊精转移酶的生产工艺，以解决发酵工艺中酶活不高，工业应用成本高等难题。

本发明成功构建含有表达载体pET28(+)-cgt并转化E. Coli BL21(DE3)宿主菌，通过摇瓶发酵条件优化，成功实现了β-CGT酶的高效胞外表达，为其大规模生产奠定了基础。

（1）菌株（大肠杆菌）：以 E. Coli BL21(DE3)(pET28(+)/cgt) 为出发菌株（谢振荣, 赵三军, 唐湘华等. 来源Paenibacillus sp.的β-环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[J]. 食品科技, 2010, 35(11): 16~19.）；

（2）种子培养阶段：将-80℃甘油保藏的菌株接入种子培养基，使用恒温培养摇床培养12小时，转速150rpm，温度35～37℃；

（3）发酵阶段：按照1-2%的接种量接种至200ml液体发酵培养基中，放于恒温摇床中发酵培养，温度控制在35-37℃，转速控制在150-160rpm，培养6-8个小时；

（4）诱导阶段：当菌体OD₆₀₀达到1.4-1.6时，加入乳糖诱导，保证乳糖的终浓度为4～6g/L，温度保持在35-37℃，转速提高至170-180rpm，诱导8-9个小时后过滤，所得液体即为β-环糊精葡萄糖基转移酶粗酶液。

所述大肠杆菌 E. Coli BL21(DE3)(pET28(+)-cgt)的构建方法为：将来源于Paenibacillus sp.XW-6-66的β-环糊精葡萄糖基转移酶基因（谢振荣, 赵三军, 唐湘华等. 来源Paenibacillus sp.的β-环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[J]. 食品科技, 2010, 35(11): 16~19.）插入质粒pET28(+)，构建了表达载体pET28(+)/cgt，并将其转化宿主菌E. Coli BL21(DE3)；

所述种子培养基组成为：4-6g/L酵母粉，9-11g/L蛋白胨，9-11g/L NaCl,pH 7.0-7.2，并含有浓度为0.05mg/ml的卡那霉素。

所述发酵培养基组成为：4-6g/L酵母粉，9-11g/L蛋白胨，9-11g/L NaCl，1-1.25mmol/L CaCl₂，2-2.5mmol/L MgSO₄.7H₂O,pH 7.0-7.2，并含有浓度为0.05mg/ml的卡那霉素。