[发明专利]一种用于蛋白质或者活性多肽生产和递送的食品级重组乳酸菌及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于蛋白质或者活性多肽生产和递送的食品级乳酸菌活载体及其制备方法。更具体地说，本发明涉及一种用于生产和递送抗原蛋白质、抗体蛋白质、营养性蛋白质、活性多肽、蛋白类激素、细胞因子等蛋白质或者活性多肽的食品级重组乳酸菌，及其制备方法。

技术背景

人或动物的胃肠道黏膜、呼吸道黏膜和生殖道黏膜存在着丰富多样的药物相关受体，是许多蛋白质或者多肽药物的靶标。其中，胃肠道系统同时又是一个复杂的大型器官，行使着十分重要的生理功能，包括食物的摄入、免疫调节、能量平衡和新陈代谢等。在胃肠道、呼吸道和生殖道中，存在着大量的微生物，既包括有益菌，如乳酸菌，也包括病原微生物。

乳酸菌为革兰氏阳性菌，属于益生菌。近年来，随着乳酸菌基因组学的不断发展和遗传操作工具的不断丰富，乳酸菌逐渐发展为理想的生产蛋白质或者活性多肽的细胞工厂和递送活载体。应用于食品、饮料及饲料产品中的乳酸菌的表达系统必须是食品级的。即所应用的宿主菌、诱导物及载体三者都必须是食品级的。首先，重组蛋白表达所使用的宿主菌必须是安全的、特征清楚且稳定的食品级微生物；其次，诱导物必须是食品级的、可被人食用或对人无害的物质，或温度、酸诱导等对人体无害的条件；另外，载体也必须是食品级的，不能有非食品级的功能性DNA存在，与食品级表达系统有关DNA必须来源于食品级微生物，且不含抗生素抗性基因，没有有害化合物产生。这样的表达系统才适用于大规模工业生产。

使用乳酸菌作为蛋白质或者活性多肽生产和递送载体，首先要将乳酸菌菌株改造为一个药物蛋白质或者多肽的“细胞工厂”，包括：a)建立乳酸菌的营养缺陷型，即将一个乳酸菌生存所必须的基因从染色体敲除(通常为胸苷酸合成酶基因thyA)，这样，当乳酸菌被人或动物排放到环境中时，乳酸菌细胞会迅速死亡，以避免基因在环境中的扩散；b)构建合适的表达框，以保证目标药物蛋白质或者多肽能够在适当的水平进行表达、有效地分泌到细胞外或者展示在乳酸菌细胞壁；c)要保证蛋白质的正确折叠，保持正确的三维结构和生物活性；d)将整个表达框插入到乳酸菌的染色体，并去掉基因操作过程中所引进的所有抗生素抗性基因，以保证产品的生物安全性。然后，重组乳酸菌可以通过常规发酵技术进行发酵生产，经过冻干处理，可以制备成胶囊、片剂或者冲剂，用于直接口服。

美国专利“Lactobacilli harboring aggregation gene as a vaccine delivery vehicle(US006100388A，2000年)”公布了一种将外源抗原蛋白质与凝聚基因(aggregation gene)或者粘蛋白结合因子融合表达的方法，将罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)开发为疫苗载体。美国专利“Bacterial delivery ofbiologically active polypeptides(US8066987B2，2011年)”公布了一种使用革兰氏阴性菌递送生物活性多肽的方法。本发明所使用的乳酸菌为革兰氏阳性菌，同时，所使用的遗传调控元件均不在上述专利所保护范围。

使用食品级乳酸菌作为细胞工厂和递送活载体生产和递送蛋白质或者活性多肽具有如下优势：

1)由于具有良好的安全性，表达外源蛋白质或者活性多肽的食品级重组乳酸菌可以用于直接口服，相对于需要注射的蛋白质或者多肽药物，口服给药更易于被患者接受，治疗成本更低。该产品也可以直接应用于饲料发酵、饲料添加等。

2)可以将蛋白质或者多肽随着乳酸菌高效靶向于消化道黏膜、呼吸道黏膜，或者生殖道黏膜。由于乳酸菌活载体蛋白质或者多肽是由食品级重组乳酸菌在人体或者动物体内原位合成和释放，这些蛋白质或者多肽可以仅在靶标位置积累起相对较高的浓度，而对于非靶标位置，积累的浓度极低，所以引起的副作用也极低。相比之下，传统的蛋白质或者多肽需要注射或者静脉进入人体或者动物体，然后通过遍布全身的循环系统而到达靶标，但同时也大量分布到非靶标组织和器官，既带来一定的副作用，也是一种浪费。

3)良好的代谢动力学。在食品级重组乳酸菌定殖于消化道黏膜、呼吸道黏膜，或者生殖道黏膜期间，外源蛋白质或者多肽是随着乳酸菌细胞的生长和分裂逐渐释放的。这起到了药物的缓释作用，也模拟了动物体自身的细胞因子的合成和释放过程，符合最理想的药物代谢动力学要求。而传统的蛋白质或者多肽药物由于是一过性给药，药物在给药后迅速达到峰值，而后迅速衰减。