[发明专利]MEK1基因突变的快速检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，分子诊断，实时定量PCR技术。

背景技术：

MEK1基因位于人染色体15q22.1-22.33，基因全长约104kb，转录后mRNA长2603bp，编码一个由393个氨基酸残基组成的丝裂原活化蛋白激酶激酶，是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。

MEK1蛋白参与MAPK级联信号传导，其受MAPKKK激活，活化后的MEK1通过共价修饰即双位点磷酸化激活MAPK。MAPK活化后，磷酸化下游底物（转录因子、蛋白激酶、酶、结构蛋白等），以此调控细胞的生长、增殖、分化、凋亡和粘附、迁移等过程，继而影响肿瘤的发生、侵袭、转移以及耐药性。

MEK1基因的突变与多种肿瘤的发生发展相关。其突变位点分布广泛，热点突变位点集中于外显子2和外显子3，如图1所示。Estep等研究显示，卵巢癌中易发生外显子2上D67N的突变。Marks等研究显示，在肺癌中存在外显子2上K57N突变。Murugan等研究显示，在结肠癌中存在D67N突变，在黑素瘤中存在K57N突变。这些结果显示，针对MEK1基因突变的检测对多种肿瘤的预防和早期诊断有重要意义。

高分辨率熔解曲线(HRM)是传统的熔解曲线分析的延伸:它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR与专门的分析算法。使我们可以不必测序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异(SNPs,mutations)。

SYBRTM Green I对PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应扩增有毒性，因此必需使用低浓度的染料，又因为它是非饱和态结合，染料在熔解过程中可重新结合，使其无法适用于HRM。

罗氏开发了一种新的适用于HRM的染料ResoLight或LC Green，它有三个优点：饱和染料毒性低；高浓度可以使DNA达到饱和；降低了染料位置重组的可能。

而，PCRPCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应产物的高分辨率熔解曲线HRM的要求:

仪器:高分辨率高均一性的仪器，确保结果差异仅受DNA模板的影响

试剂:稳定可靠的PCR与HRM染料，确保获取高分辨率熔解曲线

软件:高分辨率熔解曲线分析专用软件

罗氏荧光定量PCR系统LightCycler Nano System具有光源好、温控好、检测好、加热快的优点，完全能满足检测的要求，这台仪器也于近期通过了国家药监局的审批，适用于临床诊断检测。

LightCycler Nano System是LightCycler 480 System的缩小版，480在HRM领域发表的文献是当前发表文献最多的实时定量PCR

系统：应用领域包括人类疾病、植物、微生物、病毒、药理、毒理、生理、诊断等；影响因子10分以上5篇，包括Nature,Nature Methods,Nature Genetics，影响因子5－10分10篇，5分以上文章占总数的18％逐年上升趋势明显，已经成为当前qPCR扩展应用的热点目前常常使用测序法来检测是否存在突变，但是总结下来，现有的测序法有三个缺点：

第一：灵敏度不高，低比例突变（＜20%）无法检测；

第二：耗时长，一般需要2-3天；

第三：成本高。

鉴于以上的问题，一种灵敏度高、耗时短、成本低、可操作性能更高的实MEK1基因突变的快速检测方法的发明是势在必行的。

发明内容：

本发明要解决的技术问题主要是：现有的测序法有三个缺点：

第一：灵敏度不高，低比例突变（＜20%）无法检测；

第二：耗时长，一般需要2-3天；

第三：成本高。

为了解决以上问题，本发明提供了一种丝裂原活化蛋白激酶1（Mitogen Activated protein Kinase Kinase 1，MEK1/MAPKK1）基因突变的快速检测方法，本发明技术在突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物，两者分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型(Tm的不同)：PCR产物的Tm取决于GC含量.

高Tm G∶C>A∶T>G∶G>G∶T=G∶A＞T:T=A∶A>T:C>A∶C>C∶C低Tm