[发明专利]Caveolin-1基因突变的快速检测方法

权利要求书

1.一种Caveolin-1基因突变的快速检测方法，其特征在于，其包括如下实现步骤：

在Caveolin-1基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；

分别扩增出野生型模板和突变型片段，再用野生型引物对两种突变型片段进行PCR扩增，扩增对应的突变型模板；

不同比例混合野生型模板和突变型模板，用HRM方法进行区分。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR产物的Tm取决于GC含量。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述纯合子包括野生型纯合子或突变纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线；杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述不同比例混合这两种模板，使突变型模板的含量为1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法进行区分。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：设计了Caveolin-1P132L的野生型引物和突变型引物。

6.根据权利要求1所述的一种Caveolin-1基因突变的快速检测方法，其特征在于，其包括如下步骤： 

样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；

DNA提取：取200μL抗凝血用试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测；

qPCR-HRM检测，包括：对照孔的设立和检测重复孔；10μL反应体系构成；在八连管中依照次序加入各试剂，混合均匀；所有样本混合完后，将八连管置于罗氏荧光定量PCR系统仪器中进行程序性检测；

结果分析及判定：在高分辨率熔解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述qPCR-HRM检测的程序包括：95℃变性10分钟；95℃变性10秒钟；退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65℃，每个循环降低1℃，时间为10秒钟；72℃延伸30秒钟；重复第2步到第四步45个循环;95℃变性60秒钟；40℃变性60秒钟；设置高分辨率熔解温度从60℃到95℃，缓变率是0.05℃/s）。

8.根据权利要求1或6任一所述的方法，其特征在于:所述野生型目的片段的获取包括：以已知未突变基因组为模板，Caveolin-1F+Caveolin-1R为引物进行实验，获得条带单一的特异性野生型目的片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度约为10ng/μL，作为检测野生型阴性对照模板用。

9.根据权利要求1或6任一所述的方法，其特征在于：所述Caveolin-1突变型目的片段的获取包括： 

第一步利用带有突变位点的突变引物（Caveolin-1P132L F,Caveolin-1P132L R）获得突变位点前后两段突变片段；

第二步将这两段突变片段连接起来，构成Caveolin-1突变型目的片段。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1)突变第一步PCR，以稀释后的野生型目的片段为模板，分别以Caveolin-1F+Caveolin-1P132L R，Caveolin-1P132L F+Caveolin-1R为引物进行两组实验，获得两个条带单一的片段；

2)突变第一步产物稀释，将突变第一步获得的两段PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10ng/μL；

3)突变第二步PCR，以稀释后的第一步两段产物为模板，以Caveolin-1F+Caveolin-1R为引物进行第二步PCR，获得条带单一的片段；

4)突变第二步产物稀释，将突变第二步获得的PCR产物稀释1万-10万倍，终浓度约为10ng/μL。