[发明专利]氨基脲衍生物的单克隆抗体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体及其应用，尤其是氨基脲衍生物的单克隆抗体及其应用，属于免疫化学技术领域。 

背景技术

呋喃西林（nitrofurazone）属于硝基呋喃类药物，是一种广谱抗菌药，因价格低廉、效果好，被作为治疗药物和饲料添加剂用于畜、禽、水产养殖中控制疾病。呋喃西林分子中的药效基团—硝基是其作为药理作用及毒性产生的主要原因，同时也使得呋喃西林具有致畸、致癌性及诱发哺乳动物细胞染色体损伤等副作用。欧盟于1995年将呋喃西林列为禁用药。中国农业部2002年4月发布的第193号公告中，呋喃西林被列入《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》中，在所有食品动物中禁用，2003年又将水产品中硝基呋喃代谢物纳入残留监控计划中。但由于呋喃西林具有很好的治疗及预防效果，目前仍在水产养殖、畜、禽中被广泛使用，从而导致食品中呋喃西林残留日趋严峻。因此，为保护消费者健康，增强中国动物源性食品检疫力度、扩大贸易出口，对动物源性食品中氨基脲（SEM）残留的检测是非常必要的。 

呋喃西林原型药在动物体内很快代谢成氨基脲，而在组织中结合的代谢产物则能存留较长的一段时间，被视为呋喃西林残留的标示物，所以通常通过分析其代谢产物SEM来分析呋喃西林残留。目前用于呋喃西林残留标示物SEM的检测方法有液液萃取-高效液相色谱、固相萃取-高效液相色谱法（SPE-HPLC）、液相色谱质谱联用仪等方法。但这些仪器方法所需仪器价格昂贵，耗时长，对操作人员的要求较高，不适合在基层单位推广，不适合高通量的样品快速筛选。免疫化学分析法特别是酶联免疫吸附分析技术（ELISA）具有快速、灵敏度高、操作简单、专一性好等优点，适合高通量的样品筛选。 

本研究将小分子药物氨基脲与对醛基苯甲酸进行衍生化实验,引入活性基团—羧基，并通过混合酸酐法将该衍生物与载体蛋白偶联获得人工合成的完全抗原，该法合成的完全抗原，通过交联臂对醛基苯甲酸的作用，可以将小分子药物氨基脲充分暴露出来，使机体更容易识别抗原决定簇，提高抗原的免疫原性。以制备的完全抗原免疫Balb/c鼠，通过融合筛选得到能够识别氨基脲衍生物的单克隆抗体，从而为呋喃西林代谢物残留检测的免疫学方法奠定基础。 

发明内容

    本发明要解决技术问题是：针对以上现有技术存在的缺点，提 

出一种氨基脲衍生物的单克隆抗体，并将该单克隆抗体应用于检测呋喃西林代谢物。该方法具有操作简便、成本低廉、高通量、特异性强的特点。

本发明所涉及的杂交瘤细胞株9B10已于2011年7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC No.5072，分类命名为抗氨基脲衍生物单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

由以上杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体命名为9B10’，其制备步骤如下： 

a.制备免疫原和包被原：采用对醛基苯甲酸法将载体蛋白（BSA）与氨基脲小分子偶联，合成免疫原和包被原；

b.动物免疫注射：以Balb/c鼠作为免疫动物，腹腔注射免疫原并加强免疫；

c.筛选动物免疫血清：用间接酶联免疫吸附法和竞争间接酶联免疫吸附法筛选免疫鼠血清；

d.制备杂交瘤细胞：取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过亚克隆获得可以稳定分泌抗氨基脲衍生物单克隆抗体的杂交瘤细胞株9B10；

e. 制备并纯化单克隆抗体：对小鼠腹腔注射杂交瘤细胞9B10，采集腹水，对腹水进行液相层析纯化，获得氨基脲衍生物单克隆抗体9B10’。

其中，步骤a所述载体蛋白为牛血清白蛋白和卵清白蛋白，对应的免疫原为SEM-BSA，包被原为SEM-OVA；所述对醛基苯甲酸法中，交联剂活化小分子衍生物的时间为1-2小时，用氨基脲小分子衍生物与载体蛋白偶联反应10-15小时。所述步骤b中的各次免疫注射剂量为50-100μg/只。所述步骤e中对免疫小鼠腹腔进行单克隆抗体细胞株的注射量为（1-5）×10⁶个/只。 

通过亚型鉴定得出本发明单克隆抗体的亚型为IgG1型。 

常规制备氨基脲衍生物单克隆抗体的方法主要是通过药物的羧基与载体蛋白的氨基偶联，本发明将氨基脲小分子通过对醛基苯甲酸进行衍生化并将衍生产物的羧基与载体蛋白的氨基偶联，从而暴露氨基脲的结构，在后期筛选过程中可以获得针氨基脲衍生物的抗体。 

本发明的再一个目的是提供该单克隆抗体在制备检测呋喃西林代谢物中的应用，主要是将其应用于制备检测呋喃西林代谢物残留的ELISA试剂盒和胶体金试条纸。