[发明专利]检测西部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及采用基于MGB探针的荧光定量RT-PCR方法检测西部马脑炎病毒的核苷酸序列和试剂盒，尤指快速的基于TaqMan针对衣壳蛋白编码区的荧光定量RT-PCR检测西部马脑脊髓炎病毒的核苷酸序列和试剂盒，适用于西部马脑脊髓炎病毒的快速分子生物学诊断和检测，可用于西部马脑脊髓炎病毒的检测，出入境检疫等，属于动物检疫领域。

背景技术

西部马脑脊髓炎病毒（western equine encephalomyelitis virus，WEEV）属于披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（Genus Alphavirus）的成员，病毒粒子呈球形，直径60-65nm。有囊膜，囊膜上有糖蛋白纤突，核衣壳中包裹有单链的基因组RNA。能感染以马为代表的多种动物宿主，西部马脑炎马对人的致死率为10%左右。我国于1990年分别从新疆乌苏县的一组赫坎按蚊和博乐县的全沟硬蜱中分离出WEEV。自然状态下，WEEV在鸟类和蚊子之间交替感染，人和马是该病毒的终末宿主。在马和人群中呈散发流行。主要发生于仲夏到秋末期间；主要临床症状为发热、厌食和精神高度沉郁，对于亚临床感染病例，病症相对温和。该病毒也可引起平胸类禽鸟的死亡。

据报道，西方马脑脊髓炎(WEE)在美国西部、加拿大、墨西哥以及中美洲和南美洲有发生。西方马脑脊髓炎常在广阔地域内发生，如在1000平方英里的范围内都可见到散发病例。西方马脑脊髓炎(WEE)主要经蚊子传播，偶尔也可经小型野生哺乳动物传播。美国西海岸温暖潮湿地区常有可传播该病的蚊虫。病毒在蚊虫和野生鸟体内的相互循环传播导致了该病的持续存在，并呈散发流行。但目前尚未发现由鸟类引起的人的感染。本病的传播媒介为蚊虫，鸟类仅为贮存宿主。在人发生WEE之前，一般该地区会有马或野鸟的发病。

本病可引起人和马的发病，人和马是该病毒的终末宿主。病马常呈亚临床感染，病症相对温和。感染马的致死率低于30％。该病潜伏期5～14天，临床症状包括发热、厌食和精神高度沉郁。严重时，病马表现为狂躁不安、失明、共济失调、精神极度沉郁、卧地不起、痉挛，最后可导致死亡。在热带或亚热带炎热潮湿、蚊虫活动猖獗的夏季，未接种西方马脑脊髓炎的马如果出现特征性的嗜睡症状，可怀疑感染本病，但确诊需要进行实验室检测。人感染本病毒后，患者表现为高热，头痛，痉挛，呕吐和嗜睡，有的迅速发展为昏迷状态而死亡。致死率一般为3～4％，明显低于脊髓部马脑炎病毒感染，儿童和婴儿感染死亡率高于成人。感染儿童中30％可能留有神经后遗症，如行动迟缓，癫痫和行为紊乱。本病成人感染率为1:1000，1～4岁儿童感染率为1:58，1岁以下婴儿感染率为1:1。

WEEV为单股正链RNA病毒，全长分别为11.5kb。它们具有甲病毒属特征的4个保守区，5’端前46nt形成带柄的环状，NSP1编码区内形成带柄环状，由24nt组成的42S与26S的结合部，位于3’端后和PolyA尾前19nt组成的区域。基因组编码4种非结构蛋白（NSP1~4）和5种结构蛋白（衣壳蛋白C，包膜糖蛋白E1、E2、E3，6K，基因排列顺序为5’-C-E3-E2-6K-E1-3’）。

西部马脑脊髓炎为我国一类动物疫病，随着动物国际贸易的日益繁荣，特别是各大型国际体育赛事的日益频繁，出入境的马匹越来越多，同时由于参赛马匹来自不同的国家和地区，健康状况参差不齐，疫情非常复杂，这些因素都可能危害我国养马业的发展和马术运动的正常开展，因此开展西部马脑脊髓炎的检测技术就显得尤为重要。

目前西部马脑炎主要靠血清学检查（免疫荧光法和ELISA），普通RT-PCR法和流行病学资料作出诊断，但存在灵敏度低或易于污染的确定，不利于病毒的快速检测。因此，需要建立更高度敏感、特异和快速的检测方法，用于随时监测该病的流行情况并加以控制，同时也可应用于马匹等动物的出入境检测，为西部马脑炎的检测提供技术支持。本研究中基于MGB短探针采用TaqMan荧光RT-PCR  一步法建立了用于WEEV检测的荧光RT-PCR检测技术，对反应条件进行了优化，使该方法高度敏感、特异。并通过灵敏度、特异性、重复性试验以及对临床样品的检测，结果进一步证明了该方法敏感、特异。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的检测西部马脑脊髓炎病毒核苷酸序列，包括引物序列和探针序列。

本发明的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的检测西部马脑脊髓炎病毒的检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：