[发明专利]一种多肽类促感染试剂

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有促进HIV感染能力的多肽，多肽序列衍生于HIV包膜蛋白GP41的近膜外区MPER。

背景技术

目前基因治疗中目的基因的转移工具分为病毒载体和非病毒载体两大类，以病毒载体如逆转录病毒和腺病毒为基础的载体系统最为常用。逆转录病毒载体优点是转染范围广，转入的外源基因可整合入宿主细胞基因组；缺点是只能整合至分裂期细胞；可插入外源基因片段小，难以满足较大基因的插入；有产生野生型病毒或辅助型病毒的可能，随机整合可能产生不良作用。而慢病毒载体的出现改善了这些问题。慢病毒载体源于逆转录病毒，以HIV-1病毒为基础，去除了毒性基因，用VSV-G包膜蛋白替换HIV-1的包膜蛋白。优点是宿主范围更广，更安全，和持久性表达。可整合至分裂期和非分裂期细胞，可插入外源片段长至5kb。因此慢病毒载体在RNAi、细胞核动物模型建立以及基因治疗等领域有着非常广泛的应用。但是，无论是逆转录病毒载体还是慢病毒载体系统，都面临一个病毒包装滴度低和感染效率差的问题。

发明内容

为了解决现有技术中逆转录病毒载体系统和慢病毒载体系统的感染效率低的问题，本发明提供了一种促进病毒感染的试剂，包括一条多肽序列，所述多肽序列为带包膜病毒的跨膜蛋白近膜外区的衍生多肽序列。跨膜蛋白的近膜外区(membrane proximal extracellular region，MPER)一般富集疏水性氨基酸，能与膜结构的脂双层结合，表现出膜扰乱活性(membrane perturbing property)。HIV-1包膜蛋白Gp41的MPER区能够插入到病毒膜外的界面区域，破坏病毒包膜的高度稳定性，以利细胞和病毒的膜脂重建和融合孔的形成。删除HIV的MPER区会造成融合过程的停滞。因此MPER区对于HIV病毒融合和感染能力的发挥具有极其重要的作用。基于此，我们推测MPER衍生的合成多肽也应该对HIV的感染有影响，并通过实验证实了此类多肽可以促进带包膜病毒的感染效力。本发明中，优选HIV-1跨膜蛋白Gp41的MPER区的衍生肽作为促感染试剂。

在一个实施方式中，本发明所述多肽序列可在Gp41的MPER天然序列基础上进一步增加碱性氨基酸。所述碱性氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸的一种或几种。增加的碱性氨基酸数目可以为一个或多个。

在一个实施方式中，上述多肽序列也可通过氨基酸单点或多点突变改造，以增强其促感染活性。

在一个实施方式中，可以通过调节缓冲液pH值和离子强度，提高上述多肽的促感染活性。

本发明的多肽类促感染试剂具有显著的促带包膜病毒的感染活性，因此对于逆转录病毒或慢病毒基因疗法的发展具有重要作用。

附图说明

图1MPER、NK13和QW13的促感染活性的比较。在96板内，多肽梯度稀释后，与HIV-1假病毒ZM214M.PL15孵育1h，加入TZM-bl(1×10⁵)细胞悬浮感染。感染过程无血清，感染4h后补10％血清。感染48h后，检测luciferase表达量。Enhancement(n-fold)＝样品值/病毒对照值。病毒终浓度(p24含量)为3.2ng/mL；图示多肽浓度指加入细胞后的终浓度。

图2NK16和NK13的促感染活性的比较。在96板内，多肽梯度稀释后，与HIV-1假病毒ZM214M.PL15孵育1h，加入TZM-bl(1×10⁵)细胞悬浮感染。感染过程无血清，感染4h后补10％血清。感染48h后，检测luciferase表达量。Enhancement(n-fold)＝样品值/病毒对照值。病毒终浓度(p24含量)为3.2ng/mL；图示多肽浓度指加入细胞后的终浓度。

图3NK16与DEAE葡聚糖的促感染活性在不同感染时间上的比较。NK16诱导的促感染能力比DEAE更快更强。感染过程无血清，感染4h后补10％血清。NK16的终浓度是60u g/mL，DEAE葡聚糖的终浓度是16μg/mL。48h后检测luciferase活性。

图4Hela细胞被FIV/VSV-G感染后的GFP荧光流式分析。FIV/VSV-G在NK16作用下，感染Hela细胞水平提高。FIV/VSV-G重组病毒在有无NK16共孵育的条件下感染贴壁的Hela细胞，感染过程无血清，感染4h后洗细胞，换完全培养基。2天后用流式细胞仪检测GFP的表达水平。