[发明专利]大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP4及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP4及其编码基因与应用。 

背景技术

土壤中的磷素多数以有机态形式存在，且一半以上为植酸及其盐类，不能被植物直接吸收利用。酸性磷酸酶是一类能够分解利用土壤有机态磷、释放无机磷供植物吸收利用的酶类总称，该酶在植物生长发育过程中具有多种生物学功能，其中以参与植物磷素吸收利用最为重要。因此，挖掘与利用酸性磷酸酶基因，对于分解土壤中的有机态磷、提高植物磷素吸收利用效率、解决当前土壤有效磷供应不足、植物磷素缺乏等问题具有重要的理论和应用价值。 

紫色酸性磷酸酶（Purple acid phosphatase，PAP）是一种广泛存在于动、植物体内的酸性磷酸酶类。根据其蛋白分子量大小，紫色酸性磷酸酶可分为两个亚家族，即编码低分子量（约35kD）和编码高分子量（约55kD）的紫色酸性磷酸酶。其中，植物低分子量紫色酸性磷酸酶与动物体内的磷酸酶比较相似，而高分子量紫色酸性磷酸酶在植物中占有较大比例。紫色酸性磷酸酶一般具有5个保守基序和7个高度保守的氨基酸残基（DXG/GDXXY/GNH（D/E）/VXXH/GHXH：下划线字体代表保守氨基酸残基）以及一个金属离子的双核中心。动物体内的PAP一般由Fe³⁺-Fe²⁺构成双核金属中心，而植物体内的PAP一般由Fe³⁺-Zn²⁺或Fe³⁺-Mn²⁺构成双核金属中心。 

关于紫色酸性磷酸酶基因的克隆与应用研究，目前已有报道。Li等从拟南芥中分离得到29个PAPs基因，半定量PCR分析发现7个PAPs基因可在低磷胁迫下诱导表达；Xiao等克隆了苜蓿中的MtPAP1基因， 经转化拟南芥证明该基因具有分解有机磷的功能。 

对拟南芥缺AtPAP26突变体的研究结果发现，AtPAP26在拟南芥有机磷利用方面起着重要作用；Wang等将拟南芥AtPAP15转入大豆，在植酸盐为唯一磷源条件下，3个转基因株系磷利用率分别提高117.8%、56.5%、57.8%。 

Liang等从菜豆中获得了PvPAP3基因，Real Time-PCR分析发现，低磷胁迫下，该基因在磷高效品种G19833的表达高于磷低效品种DOR364。由此可见，拟南芥、苜蓿、菜豆等植物中的紫色酸性磷酸酶基因具有活化植株根际周围土壤中的有机态磷、促进植株体内磷素再循环利用的功能。 

然而，关于大豆中的紫色酸性磷酸酶基因的克隆以及根际周围有机磷利用研究，目前报道甚少。 

发明内容

本发明目的是提供一种大豆紫色酸性磷酸酶及其编码基因，用于活化植株根际周围土壤中的有机态磷、促进植株体内磷素再循环利用。 

本发明另一目的是提供含有上述基因的载体。 

本发明又一目的是提供含有上述基因或载体的宿主细胞。 

本发明再一目的是提供大豆紫色酸性磷酸酶及其编码基因在提高植株植酸磷利用率中的应用。 

大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP4基因的开放阅读框（ORF）序列，如SEQ ID NO.1所示，长度为1329bp。大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP4编码的蛋白序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或该序列经替换一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，SEQID NO.2长度为442个氨基酸残基。 

应当理解，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件 下，对编码上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的基因序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码基因相同功能的核苷酸序列。本发明还包括基于所述基因的正义序列或反义序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞，利用所述宿主细胞制备大豆紫色酸性磷酸酶的方法等。