[发明专利]不水洗的革兰染色方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种革兰染色法，特别是涉及不水洗的革兰染色方法。

背景技术

革兰染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram创立。细菌先经碱性染料结晶染色，而经碘液媒染后，用酒精脱色，在一定条件下有的细菌此色不被脱去，有的可被脱去，因此可把细菌分为两大类，前者叫革兰氏阳性菌（G+），后者叫革兰氏阴性菌（G-）。为了观察方便，脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红等进行复染。阳性菌仍带紫色，阴性菌则被染上红色。有芽孢的杆菌和绝大多数和球菌，以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度低，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都呈负反应。此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫-碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。所以脱色时间，脱色方法也应严格控制。

传统的革兰染色四步法一般主要包括初染、媒染、脱色、复染四个步骤，具体操作方法是：1）涂片固定，2）草酸铵结晶紫染1分钟，3）水冲洗，4）加碘液覆盖涂面染1分钟，5）水洗，用吸水纸吸除水分，6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，30秒后水洗，吸去水分，7）蕃红染色液染10秒钟后，自来水冲洗，干燥镜检。其中在初染、媒染、脱色、复染每一步骤之后都需要水洗除去染料，避免附着的染料对染色效果的影响。革兰染色四步法效果好，但操作比较复杂，质量控制不易进行，难以做到标准化，同时消耗较多的染料和水，容易造成资源的浪费和环境的污染。

目前开发了一种革兰染色三步法，该方法主要包括初染、媒染和复染三个步骤，其中在初染、媒染和复染每一步骤之后都需要水洗除去染料，避免附着的染料对染色效果的影响，革兰染色三步法虽然相比四步法，步骤减少一步，缩短了染色时间，但该方法仍然包括三次水洗的步骤，同样消耗大量水，另外传统的革兰染色三步法仍需要消耗较多的染料，容易造成资源的浪费和环境的污染。

目前在专利CN101126689B中公开了一种水洗两次的革兰染色二步法，主要包括初染和复染两步，在每一步骤之后同样需要水洗除去附着的染料，该方法较传统的革兰氏染色四步法，操作更简便且方法可靠，但此方法同样消耗大量的染料和水，并且初染和复染的时间较长，不适于大批量的检验操作。

发明内容

本发明的目的是针对目前革兰染色三步法和革兰染色二步法中因包含水洗的步骤而导致消耗大量的水，同时使用的染料量大，染色时间长的问题，提供一种不水洗的革兰染色方法，该方法省去了水洗的步骤，节约了水资源，同时减少了染料使用量，降低了对环境的污染。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

不水洗的革兰染色方法，包括：

在室温下，将待检材料均匀涂在玻片上，干燥，固定，再将初染剂滴加到涂片上，染色，倾去初染剂后直接滴加复染剂，染色后，倾去复染剂，干后镜检，在涂片中央是染成紫色的革兰阳性菌和染成红色的革兰阴性菌，

其中所述初染剂为含有质量百分数0.03125%结晶紫的水溶液。

在现有的革兰染色方法中，水洗被认为是不可缺少的一步，因为通过水洗可除去附着在涂片上的染料，避免对染色效果的影响，然而发明人经过研究发现，在革兰染色方法中，使用稀释的染色液，减少染料的用量，省去水洗步骤对染色效果没有影响，染色效果仍与已知的方法一样好。

在本发明中，优选地，所述复染剂为含有以下质量百分数组分的乙醇溶液，其中0.0625%碱性品红、0.005%碘化钾、0.001%碘。

在本发明中，优选地，所述初染剂的滴加量为1～4ml，初染剂染色时间为10～50秒；所述复染剂的滴加量为0.8～2ml，复染剂染色时间为1～5秒。本发明更优选为所述初染剂的滴加量为2ml，初染剂染色时间为30秒，所述复染剂的滴加量为1ml，复染剂染色时间为2秒。