[发明专利]重组单纯疱疹病毒、其制备方法及应用

权利要求书

1.一种重组单纯疱疹病毒，其特征在于将含有ICP4基因的单纯疱疹病毒基因组中的ICP4基因启动子替换为人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp或其它肿瘤特异性启动子。

2.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其特征在于其微生物保藏号为CGMCC No.6397。

3.根据权利要求1所述的重组单纯疱疹病毒，其特征在于该单纯疱疹病毒剔除了ICP34.5基因和ICP47基因中的一种或两种。

4.一种制备如权利要求1或2所述重组单纯疱疹病毒的方法，其特征在于其包括以下步骤：

用人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp取代含有ICP4基因的单纯疱疹病毒中的ICP4基因启动子，构建该重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4：

(1)构建穿梭质粒pICP4del-hTERTp_ICP4和pICP4del-eGFP：

a.用BHK细胞培养该含有ICP4基因的单纯疱疹病毒，并纯化其基因组DNA；

b.扩增ICP4基因上游侧翼序列：以步骤a中所得病毒基因组DNA为模板，用以下ICP4USf正向引物和ICP4USr反向引物：

ICP4USf正向引物：CCCTCCAGACGCACCGGAGTCGGGGG

ICP4USr反向引物：AAGTCGACTCTAGAGGATCGATCTCTGACCTG

                 AGATTGGCGGCACTGAGGTA

扩增出ICP4基因上游侧翼序列；

扩增ICP4基因下游侧翼序列：以步骤a中所得病毒基因组DNA为模板，用以下ICP4DSf正向引物和ICP4USr反向引物：

ICP4DSf正向引物：AAAAGTCGACCTGCAGGCATGCTAACGAGGAA

                 CGGGCAGGGGGC

ICP4DSr反向引物：AAAAAAGCTTGCATGCCCACGTGCGCGGGGCC

                 AGACGGGCT

扩增出ICP4基因下游侧翼序列；

将上下游侧翼序列克隆到pSP73质粒上，构建pICP4del及pICP4del-eGFP质粒：将SalI酶切的前述扩增出的ICP4基因的上游侧翼序列及SalI/HindIII双酶切的前述扩增出的ICP4基因的下游侧翼序列混合并连接到pSP73的EcoRV/HindIII位点，得到pICP4del；用EcoRI/XhoI从pcDNA3.1-eGFP切下CMV启动子控制的eGFP表达盒，经T4 DNA聚合酶补平末端后插入到pICP4del的EcoRV位点，得到pICP4del-eGFP；

c.分三次PCR扩增出ICP4基因中三段序列：首先，使用以下引物：

ICP4-1^st正向引物：TTTTTTGAATTCATGGCGTCGGAGAACAAGCAGCGCC

ICP4-1^st反向引物：TGGAGCCACCCCATGGCCTCCGCGT

ICP4-2^nd正向引物：CGACGCCGCGCAGCAGTACGCCCTG

ICP4-2^nd反向引物：CGGCGGGGGCGGGCCCGGCGCACCG

ICP4-3^rd正向引物：CCTCATGTTTGACCCGCGGGCCCTG

ICP4-3^rd反向引物：TTTTTTCTCGAGTTACAGCACCCCGTCCCCCTCGAAC

以步骤a中所得病毒基因组DNA为模板，分别扩增出三段基因片段ICP4-1^st、ICP4-2^nd和ICP4-3^rd，而后分别将该三段基因片段插入pSP73质粒的EcoRV位点构建出以下三种质粒：pSP73-ICP4-1^st、pSP73-ICP4-2^nd、pSP73-ICP4-3^rd，从该三种质粒中用EcoRI和BsrGI剪切出ICP4-1^st、用BsrGI和PvuI剪切出ICP4-2^nd及用PvuI和XhoI剪切出ICP-3^rd待用；

d.从含人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp的质粒中用NruI和HindIII切下hTERTp片段，取代从pcDNA3-NHN上用NruI和HindIII切除的CMV启动子，得到质粒pcDNA3-NHN-hTERTp，其中，pcDNA3-NHN是在pcDNA3的NheI位点插入NheI-HapI-NheI酶切位点序列所得；

e.将步骤c中的该ICP4-1^st、ICP4-2^nd和ICP4-3^rd混合并连接到步骤d中的该pcDNA3-NHN-hTERTp的EcoRI及XhoI位点，得到质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4；

f.用SalI酶切步骤b中含ICP4基因上下游侧翼序列的质粒pICP4del，并补平末端待用，用PmeI和HpaI从步骤e获得的该质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4剪切出hTERTp_ICP4表达盒片段，并将其与该酶切后待用的pICP4del质粒连接，构建出质粒pICP4del-hTERTp_ICP4；

g.构建BHK-ICP4辅助细胞：用EcoRI和XhoI从步骤e获得的该质粒pcDNA3-NHN-hTERTp_ICP4中酶切出ICP4基因，并克隆到pcDNA3中CMV启动子的下游EcoRI和XhoI位点，得到pcDNA3-CMV-ICP4质粒；将该pcDNA3-CMV-ICP4质粒转染BHK细胞，该pcDNA3-CMV-ICP4质粒DNA可重组到BHK细胞基因组中，使有些BHK重组细胞获得对新霉素的抗性和表达ICP4，用抗菌素G418杀死未重组的BHK细胞，经过几轮的亚克隆筛选，用RT-PCR方法筛选出表达ICP4的BHK-ICP4辅助细胞；

(2)剔除基因组中ICP4基因启动子并插入端粒酶逆转录酶启动子hTERTp启动子：

A.用BHK细胞培养该含有ICP4基因的单纯疱疹病毒HSV，并提取病毒基因组DNA；

B.将步骤A中该病毒基因组DNA与步骤(1)b中该质粒pICP4del-eGFP共转入步骤(1)g中该BHK-ICP4辅助细胞内，经同源重组，该质粒pICP4del-eGFP中绿色荧光蛋白表达盒GFP置换了该含有ICP4基因的单纯疱疹病毒HSV的ICP4基因，使得重组病毒的毒斑发绿色荧光，经过几轮的噬斑纯化，挑选绿色荧光毒斑，就能纯化出重组病毒HSV-d4GFP；

C、培养步骤B中该HSV-d4GFP病毒，并提取基因组DNA；

D、将步骤C该重组病毒HSV-d4GFP的基因组DNA和步骤(1)f该质粒pICP4del-hTERTp_ICP4的DNA共转入该BHK-ICP4辅助细胞，经同源重组，hTERTp_ICP4表达盒置换了该重组病毒HSV-d4GFP的绿色荧光蛋白GFP表达盒，使新重组病毒的毒斑不发绿色荧光，经过几轮的噬斑纯化，挑选无荧光毒斑，就能纯化出该重组单纯疱疹病毒HSV-hTERTp_ICP4。