[发明专利]胞内劳森氏菌环介导等温扩增检测方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种胞内劳森氏菌环介导等温扩增快速检测试剂盒，其特征在于包括以下成分：

（1）环介导等温扩增（LAMP）反应液：

包括0.2 μM 的上游外引物、0.2 μM的下游外引物、1.6 μM的上游内引物、1.6 μM的下游内引物、1 M甜菜碱、6 mM硫酸镁、1.6mM dNTP、10×Thermopol反应缓冲液，其中引物序列为：

上游外引物F3：5'-AGCTAACGCGTTAAGCACC-3'

下游外引物B3：5'-CTTAACCCAACACCTCACGG-3'

上游内引物FIP：5'-CCACGTACTCCACCGCTTGTGTACGGTCGCAAGGCTGAA-3'下游内引BIP： 5'-ACCCAGGCTTACATCTGAGGGAATGCAGCACCTGTCTTGAG-3'

（2）聚合酶：每微升为8个活性单位的Bst DNA聚合酶；

（3）显色剂：SYBR Green I 荧光染料。

2.根据权利要求1所述的一种胞内劳森氏菌环介导等温扩增快速检测试剂盒，其特征在于所述LAMP反应液体系为18μL，成分组成如下：

0.2μM 的上游外引物0.4μL、0.2 μM的下游外引物0.4μL、1.6 μM的上游内引物0.5μL、1.6 μM的下游内引物0.5μL、1 M甜菜碱5μL、6 mM硫酸镁0.3μL、1.6mM dNTP 2.5μL、10×Thermopol反应缓冲液2μL。

3.根据权利要求1所述的一种胞内劳森氏菌环介导等温扩增快速检测试剂盒检测胞内劳森氏菌的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）待检样品DNA的提取

提取待检样品胞内劳森氏菌的DNA，其中提取的样品DNA在紫外分光光度计上检测，其 OD₂₆₀/OD₂₈₀ 应在1.6～2.0范围内，浓度应在10～100ng/μL范围内；

（2）胞内劳森氏菌环介导等温扩增

A. 在反应管中建立18μL的LAMP 反应液；

B. 向上述反应管中加入1μL 8U的Bst DNA聚合酶和1μL 胞内劳森氏菌 DNA模板；

C．将上述反应管置于水浴涡中65℃恒温扩增60 min；

D. 将水浴温度调到80℃放置2min从而终止反应，3～5min后取出待检；

（3）显色检测

在待检的每个反应管中加入1 μL 的SYBR GreenI染料，室温放置，肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品中含有胞内劳森氏菌，反应液颜色变为黄色，则说明待检样品中不含有胞内劳森氏菌。