[发明专利]一种激光扫描位相显微成像方法及系统

说明书

技术领域

本发明涉及一种光学成像方法及系统，特别是关于一种适用于透明生物组织成像的激光扫描位相显微成像方法及系统。

背景技术

激光扫描共聚焦显微技术是利用置于探测器前的针孔，有效屏蔽非焦面光对样品成像质量的影响，实现点扫描、点探测的成像过程，但是由于其并不具有将样品位相信息转变为强度信息的能力，因此不能对透明生物样品进行非荧光标记的结构成像，需要与其它显微成像方法融合才能对透明生物样品实现逐点扫描/探测方法。

现有技术中生物组织显微成像方法主要包括：1、微分干涉相差显微成像方法利用两块渥拉斯顿棱镜（Wollaston Prism），起偏器（Polarizer）和检偏器（Analyzer），基于宽场偏振光对透明生物组织进行成像，成像结果可以呈现生物组织的浮雕状结构，但是上述显微成像方法需要在光路中额外添加偏振元件产生偏振光，并利用两束偏振光形成的剪切角进行位相差分探测，所使用的元件价格昂贵且不能对具有双折射特性的样品进行探测。同时，宽场成像需要使用CCD相机进行数据采集，因此不利于与采用点探测器的激光扫描共聚焦显微技术融合。2、斜射照明显微成像方法是利用霍夫曼光学调制器（Hoffman Modulator）和狭缝光阑（Slit Stop），基于宽场斜入射的光源对透明生物组织进行成像，成像结果可以呈现生物组织的浮雕状结构，但是由于上述显微成像方法的光路中需要插入光学调制器和狭缝光阑，因此在实验过程中不利于不同模态间的切换，同时也因为宽场成像需要使用CCD相机进行数据采集，所以不利于与采用点探测器的激光扫描共聚焦显微技术融合。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种可以实现对透明生物样品的无标记成像，不仅能够方便不同模态之间切换，而且成像对比度和信噪比均比较高的激光扫描位相显微成像方法及系统。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种激光扫描位相显微成像方法，包括以下步骤：1）设置一包括有荧光显微镜、激光共聚焦扫描系统和光电探测系统的激光扫描位相显微成像系统；其中，所述荧光显微镜包括有物镜、管镜和扫描镜；所述激光共聚焦扫描系统包括有激光器、二向色镜、X方向扫描振镜、Y方向扫描振镜、滤波片、会聚透镜和针孔；2）将激光共聚焦扫描系统放置在荧光显微镜的入光孔处，将光电探测系统放置在激光共聚焦扫描系统的出光方向，使激光器出射激发光的高度与荧光显微镜入光孔中轴线的高度相当；3）调节各光学元件之间的角度，使成像系统满足光学显微系统的物象共轭关系；4）将一样品切片放置在荧光显微镜的试验台上，所述样品切片包括盖玻片、生物样品以及载玻片；5）在载玻片上添加荧光介质；6）激光器发射激发光经二向色镜进行分光，出射的激发光依次经X方向扫描振镜和Y方向扫描振镜扫描成光栅面，并将其经扫描镜和管镜聚焦扩束后发射到物镜，并经盖玻片聚焦在生物样品上；7）聚焦在生物样品的激发光透过生物样品照射荧光介质，荧光介质被激发光激发发射荧光；8）荧光照射并透过生物样品沿着原光路返回，即依次经物镜、管镜、扫描镜、Y方向扫描振镜、X方向扫描振镜发射到二向色镜进行分光，出射的荧光发射到滤波片并经会聚透镜聚焦进入针孔，经针孔出射的荧光由光电探测系统接收处理得到生物样品的浮雕状结构。

所述步骤3）中调节各光学元件之间的角度具体操作为：调节X方向扫描振镜与物镜之间的角度，使进入物镜前的激发光光轴方向与物镜中轴线之间的角度为θ，α₁〈θ〈α₂，其中，α₁为激发光扫描视场角，α₂为物镜的数值孔径角。

所述步骤3）中调节各光学元件之间的角度具体操作为：调节X方向扫描振镜与物镜之间的角度，使进入物镜前的激发光光轴方向与物镜的中轴线重合，并调节会聚透镜与针孔之间的位置，使经会聚透镜聚焦的荧光与针孔中轴线之间的角度为β，α₁·γ〈β〈α₂·γ，其中，γ为角放大率，α₁为激发光扫描视场角，α₂为物镜的数值孔径角。