[发明专利]一种促进胞外蛋白基质分泌的方法和其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种促进胞外酶分泌的的方法和其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

在制备重组蛋白的众多表达系统中，大肠杆菌表达系统凭借培养条件简单，生长周期短，表达效率高等优势被认为是实现规模化制备重组蛋白的有效表达系统之一。根据最终定位方式，采用大肠杆菌表达系统表达外源蛋白有三种形式：胞内表达、周质表达以及胞外基质表达。与胞内及周质空间定位相比，重组蛋白分泌至胞外基质中，不仅有助于蛋白的折叠，降低包涵体的形成几率，而且免除了通过菌体破碎或周质释放来回收目的蛋白步骤，大大减少了宿主菌杂蛋白污染，提高了下游纯化效率。因此，基质表达在生物产品规模化生产中具有重要的意义。

根据大肠杆菌的两层细胞膜结构，生理条件下，大肠杆菌共有I-V型5种分泌蛋白的方式。重组蛋白的基质分泌一般采用绝大部分大肠杆菌自身蛋白跨膜转运所采纳的由SecB介导的II型分泌途径。在大肠杆菌中，当目的蛋白N末端有一段约20-30个氨基酸残基组成的Sec途径特征性信号肽序列(如PelB、OmpA、MalE等)时，前体目的蛋白从核糖体中合成后即与转运伴侣蛋白SecB结合，开始SecB途径介导的蛋白胞内运输与跨内膜转运，当前体蛋白的N-末端信号肽跨过内膜暴露于位于内外膜之间的周质空间时，周质空间中存在的特异性信号肽酶将信号肽切除，然后在一系列伴侣蛋白的帮助下完成构象折叠，并可进一步跨外膜于胞外基质中。

由于外源蛋白在大肠杆菌中极易获得较高的合成速率，故在分泌型表达研究中，如何强化分泌过程尤为重要。研究者一般通过研究转运蛋白之间以及目标蛋白和转运蛋白之间的相互作用机制，强化蛋白分泌过程或者在不引起菌体裂解的情况下构建外膜渗漏突变型菌株、添加适量可导致膜通透性增加的化学添加剂来强化跨膜转运过程。

角质酶是一种多功能酶，可水解各种可溶性酯类、乳化的甘油三酯、不溶性脂肪酸酯、不溶性多聚体角质等。前期工作已表明T.fusca角质酶具有磷脂酶的水解活性，并且可通过角质酶对大肠杆菌细胞膜磷脂成分的有限水解作用提高细胞膜的通透性来实现无信号肽的角质酶自身(吴敬，宿玲恰，陈晟，陈坚：一种基质表达T.fusca角质酶的方法.201210241426.7)和胞内目标蛋白(吴敬，宿玲恰，陈晟，陈坚：一种将胞内蛋白基质表达的方法和其应用.201210045965.3)的基质表达。本发明在此基础上利用该作用来促进胞外酶的基质分泌型表达。

本发明选取两种重要的工业用酶α-高温酸性淀粉酶和内切-β-1，4-木聚糖酶作为报告蛋白。α-淀粉酶(α-1，4-葡萄糖-4-葡萄糖水解酶)可在淀粉分子链中间切断α-1，4糖苷键，生成可溶性糊精、低聚糖及少量麦芽糖、葡萄糖。其中α-高温酸性淀粉酶由于其优良的耐热性和耐酸性被广泛应用在以淀粉为原料的工业生产中。内切-β-1，4-木聚糖酶可从木聚糖主链内部随机作用于β-1，4-糖苷键，将木聚糖分解成低聚木糖，在食品、饲料、造纸等行业均具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明提供了一种促进胞外蛋白基质表达的方法，是将T.fusca角质酶基因(NCBI编号：AAZ54921)和目标蛋白基因在宿主菌大肠杆菌中共表达，经发酵培养，收集发酵上清液。

为解决上述技术问题，具体方法为：

1)将本研究室前期构建的Tfu_0883/pETDuet-1和含有胞内目标蛋白基因的重组质粒pET20b(+)进行双酶切，连接酶连接过夜，连接产物转化E.coliJM109感受态细胞，得到含有目标蛋白基因的重组质粒Tfu_0883/pETDuet-1；

2)将含有目标蛋白基因的重组质粒Tfu_0883/pETDuet-1导入宿主大肠杆菌；

3)步骤2)构建的重组大肠杆菌发酵生产目标蛋白，收集发酵上清液。

所述宿主菌可以为：E.coli BL21(DE3)、E.coli W3110、E.coli JM109、E.coliJM109(DE3)、E.coli DH5α等，其中优选E.coli BL21(DE3)。

所述携带角质酶和目标蛋白的载体为pETDuet-1、pCOLADuet-1等双启动子载体；pUC系列，pET系列，pT7-7，pGEX等任意一种。

所述胞外目标蛋白是指在细胞质核糖体中合成后，在一系列转运蛋白的帮助下通过特定的分泌途径(I型-V型)跨内外膜最终定位于基质培养基中，其中优选SecB介导的II型分泌途径。