[发明专利]一种利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K2的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产维生素K₂的方法，特别涉及一种利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K₂的方法。

背景技术

维生素K（MK）是一类含有甲蔡醒结构的抗出血性化合物的总称，又名为凝血维生素或抗出血维生素。维生素K（MK）可分为两大类，一类为脂溶性化合物K₁、K₂和K₃，可在动植物体内提取；另一类为水溶性化合物K₄，人工化学合成。最重要的为K₁、K₂和K₃，商品用维生素K是维生素K₃的衍生物。在动物体内，具有生物活性的是K₂，而维生素K₁和K₃需要在肝脏内转化为K₂才能发挥功能。

维生素K₂不仅在血液凝固过程中，在骨骼代谢上也有着重要作用，已被广泛用于骨质疏松等疾病的预防和治疗。维生素K₂是肠道群细菌的代谢产物，在发酵过程后的某些食品中有少量的维生素K₂，发酵纳豆食品中维生素K₂含量尤其丰富。文献报道指出目前能够用于发酵生产MK的菌种主要是革兰氏阴性菌的产黄杆菌和属于革兰氏阳性菌的纳豆芽孢杆菌。Yoshinori T等和Toshiro S等发现分别对纳豆中分离的芽孢杆菌进行诱变处理后可以提高维生素K的产量。

原生质体融合起源于20世纪60年代，并于70年代逐渐发展起来的重要基因重组技术。是通过酶或机械的方法除去细胞壁，使双亲株的微生物菌体细胞形成球状原生质体，经过物理、化学或生物方法使双亲株的原生质体融合，再发生染色体基因组间的交换重组，使融合子具有双亲的优势性状，在适宜的培养条件下再生细胞壁，经过合理的筛选，从再生菌体中获得重组子。

近年来，该技术已成为细胞生物学研究领域迅速发展的方向之一。该技术不仅能够改良菌种遗传性状、提升有用代谢产物产量，还能综合不同菌株的代谢特性，产生新的有用代谢产物，在工业生产和遗传育种上展示出美好的应用前景。实践证明，利用原生质体融合技术可以获得具有双亲优良特性的融合子，并且细菌之间的原生质体融合可以克服细菌种属之间的差异而实现基因重组。

谷吉树等试验了甘油、葡萄糖、果糖和可溶性淀粉等十几种碳源对产黄杆菌生产MK的影响，发现以甘油为碳源的培养基中MK的含量最高。纳豆芽孢杆菌发酵时，尽管以蔗糖为碳源细胞增长最快，但以甘油为碳源时MK的产量最高。以大豆提取物为氮源时，MK-7产量最高，而且由于大豆提取物是纳豆加工的副产物，因此价格也很便宜，是一种理想的氮源。酵母膏不适合单独作氮源，但在另外加有氮源后，适当添加酵母膏会增加MK产量。无机盐中，K₂HPO₄对MK特别是MK-4的影响很大，产黄杆菌发酵时需加入K₂HPO₄、MgSO₄和NaCl，但是枯草杆菌的培养基中只需加入K₂HPO₄。

因此，特别需要一种利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K₂的方法，以解决上述现有存在的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K₂的方法，针对现有技术的不足，提高了维生素K₂的产量，为实现维生素K₂规模化生产提供了有效方法。

本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现：

一种利用纳豆芽孢杆菌生产维生素K₂的方法，其特征在于，它包括如下步骤：

（1）用纳豆芽孢杆菌BS-5突变体BS-53原生质体和纳豆芽孢杆菌CICC10262原生质体融合后筛选获得的高产菌株BKU-6；

（2）纳豆芽孢杆菌菌株BUK-6复合后，接种于20ml的种子培养液中进行恒温培养，再接种5%的活化培养基于100ml发酵培养基中进行发酵；

（3）发酵液中加入异丙醇和正已烷混合物处理，处理后进行离心处理，取上清液过滤；

（4）滤液经挥发后即可得到维生素K₂的油状物，经过真空冷冻干燥后即可得到黄褐色维生素K₂的成品。