[发明专利]制备生物柴油催化剂的脂肪酶酯化活力的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及脂肪酶催化技术领域，具体是一种作为制备生物柴油催化剂的脂肪酶酯化活力的测定方法。

背景技术

脂肪酶种类繁多，催化特性千差万别，所以有目的的选择所要的脂肪酶是催化过程的关键，酶的选择取决于酶活力的测定方法，绝大多数的脂肪酶酶活测定方法都是基于测定脂肪酶的酯化活力，但是由于这一反应易受底物影响发生逆反应，即酯化或酯交换反应。脂肪酶的活性中心存在一个由三个氨基酸（丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸）组成的三联体，这个活性中心上方有一个螺旋片断，或者说是一个“盖子”，这个盖子的外表面相对亲水，而其面向催化部位的内表面则相对疏水。在通常的水溶液当中，活性中心被这个盖子盖住，而在油/水界面，由于界面能的作用，酶的空间构象发生变化，盖子打开，使活性中心暴露在反应体系当中，这使得底物与酶的结合能力增强，此时底物就很容易进入疏水性的通道而与活性部位结合，形成酶-底物复合物，促进反应进行，这就是脂肪酶为什么只在两相界面起作用的原因。

在自然界中，很多种动植物都以甘油三酰酯的形式储存能量，脂酶是动植体内用来水解这一类物质的酶类，脂肪酶是一种特殊的酯酶，它只在油水界面起作用。与其它的酶类相比，脂肪酶所能催化的底物范围广，而且对有机溶剂的耐受性更强，可以催化多种类型的反应，所以具有更大的应用潜力。脂肪酶催化的反应类型可以分为：

a.水解反应：脂肪酶的基本功能是催化甘油三酰酯的水解，同时一系列不同分子量的酯、硫醇酯、聚酯等都可以作为酶催化水解反应的底物。脂肪酶催化油脂的水解也是目前脂肪酶最广泛的应用领域。

b.酯合成反应：脂肪酶的基本功能是催化酯的水解，但是这一反应的自由能很小，所以反应平衡受反应物浓度影响很大，通过改变反应条件，如在无水体系或有机溶液中可以很容易的使水解反应发生逆转，进行水解的逆反应即酯化或酯交换反应。脂肪酶催化的反应可以分为酯化、酯交换、酸解和醇解反应，其中后三种又可以统称为转酯化反应，另外除了催化酸与醇的酯化反应外，还可以催化酰胺的合成。

 

目前，一些研究者基于酯化和转酯化反应，探索出了脂肪酶酯化活力的测定方法，但是这些方法大多都采用GC、HPLC、对硝基苯酚法或者荧光显色法，而这些方法的缺点在于当样品量大或者用于筛选工作时，需要大量实验和时间消耗，且价格昂贵，对反应溶剂要求高。

发明内容

本发明的目的是提供一种作为制备生物柴油催化剂的脂肪酶酯化活力的测定方法，该方法用于筛选可用于制备生物柴油的脂肪酶产生菌，开发更多的用于生物柴油制备以及催化酯合成的脂肪酶制剂，所用底物价格便宜，测定方法简单易行，绝大多数实验室的仪器和设备均可满足要求。

本发明用脂肪酶在微水相体系条件下催化月桂酸和月桂醇在恒温摇床中发生酯化反应，温度设定为30℃-70℃，反应30min后，吸取2ml的反应液放在另外的三角瓶中，加入10ml的乙醇-丙酮终止液和100ul的酚酞显色液后，用0.05M的NaOH标准液来滴定，直至pH等于10.3为滴定终点，记录NaOH的消耗量，1g固体酶粉或1ml液体酶催化底物进行酯交换反应，1min内消耗的月桂酸的量，根据消耗的NaOH的量来测定脂肪酶酯化活力。

反应温度和水添加量对于不同的脂肪酶有所不同，本发明还可以根据脂肪酶不同的底物而特异性改变底物碳链的长度。

反应原理

本发明所述的微水相中脂肪酶酯化活力的快速测定方法，酯化反应条件为：

月桂酸和月桂醇的浓度均为0.2M，水加入量为与底物的体积比为1:1000—3:1000，脂肪酶量为30-50mg。

本发明的方法具体按照下述步骤进行：

① 月桂酸-月桂醇基准液的配制：称取20g月桂酸和18.5g（约22.55ml）月桂醇于500ml烧杯中，加入适量异辛烷使其溶解，并定容到500ml，作为基准液备用；

② 称取脂肪酶样品适量，分别置于两个具塞的三角瓶中，编号为A和B，在向两个三角瓶中分别加入10ml的月桂酸-月桂醇基准液作为底物和与底物体积比为1:1000—3:1000，迅速摇匀，将其置于30-70℃，180—220rpm的恒温摇床中，反应30分钟后，迅速从两个三角瓶中各取2ml，放入另外两个三角瓶中，加入10ml乙醇-丙酮终止液终止反应和加入100ul酚酞指示剂后，在三角瓶中放入一枚转子，同时将pH计的探头浸入液体中，在磁力搅拌器上边搅拌，边用0.05M的NaOH标准液来滴定，直至pH等于10.3为滴定终点，记录消耗的NaOH的量V₁；