[发明专利]一种高通量Small RNA测序获得番木瓜环斑病毒基因组序列的方法

权利要求书

1.一种番木瓜环斑病毒海南分离物PRSV-HN-y1全基因组的基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述番木瓜环斑病毒海南分离物PRSV-HN-y1全基因组编码的多聚蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种高通量Small RNA测序获得番木瓜环斑病毒海南分离物PRSV-HN-y1全基因组序列的克隆方法，包括以下步骤：

（1）从感染番木瓜花叶病样品中提取总RNA，将sRNA片段从中分离出来；

（2）通过运行Bowtie软件（默认参数）将sRNA片段与Genbank中所有已知的病毒基因组序列进行比对，筛选出高度匹配的小RNA片段；

（3）运行Velvet软件，参数设置为k-mer=17和minimum coverage=5，以步骤2中获得的小RNA片段为输入，拼接成短的重叠群序列； 

（4）运行Blast软件（默认参数）将获得的短的重叠序列与Genbank数据库中的已知病毒基因组序列进行比对，以此推测序列的来源物种；

（5）从Genbank数据库下载所有可疑来源物种的全长基因组序列并以此数据为基础建立可以用于Bowtie软件进行序列比对的病毒数据库；

（6）运行Bowtie软件（默认参数）将sRNA片段与特定病毒物种的基因组序列进行比对，筛选出高度匹配的sRNA片段；

（7）将能够匹配到最多小RNA片段的病毒株系默认为最可能的候选病毒；

（8）将获知的候选病毒信息设计一个简单的标记，对小RNA片段进行标记；

（9）运行Velvet软件，参数设置为k-mer=1 7和minimum coverage=5，以步骤8中获得的小RNA片段为输入，将其拼接成短的重叠群序列；

（10）运行Velvet软件，参数设置为k-mer=17和minimum coverage=5，以步骤9中获得的短的重叠群序列为输入，拼接成更长的重叠群序列；

（11）人工检查步骤10中获得的重叠群序列，找出未能拼接好的gap区域；从gap区域两侧设计特异性PCR引物，通过基因克隆和测序获得gap区域的序列信息，填充gap区域，最后将获得的重叠群序列最终连接成一条完整的病毒基因组序列，即番木瓜环斑病毒海南分离物PRSV-HN-y1全基因组序列。

4.权利要求3所述高通量Small RNA测序获得番木瓜环斑病毒基因组序列的方法，适用于番木瓜环斑病毒，也适用于与Genbank中登陆已知病毒基因组相近的病毒，该方法中只要有足够的小RNA数据，通过权利要求3所述方法不但可以获得一个与Genbank中有匹配的病毒全基因组序列，还可以根据一些很短的重叠群序列通过基因克隆技术获得自然界中未知的新病毒全基因组序列。