[发明专利]一种测定超氧化物歧化酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种测定超氧化物歧化酶活性的方法。

背景技术

活性氧包括超氧阴离子、羟基自由基、过氧化氢、单线态氧等，这些粒子均十分微小。由于存在未配对的自由电子，活性氧的化学性质十分活跃。活性氧往往是生物生化过程中的一种副产品，当其过量时，机体内的活性氧会对细胞和基因结构造成损坏，引发多种疾病，如细胞毒性、衰老、癌症等。超氧阴离子是其他几种活性氧的源头，超氧化物歧化酶能够清除机体中过量的超氧阴离子，它能够催化超氧阴离子发生歧化反应，产生氧气和过氧化氢，具有抗炎、抗病毒、抗衰老等作用。因此，近年来，对测定超氧化物歧化酶活性的方法的研究备受关注。

现有的测定超氧化物歧化酶活性的方法主要是黄嘌呤氧化酶-NBT法、肾上腺素自氧化法、Marklund邻苯三酚法、化学发光法等。但是黄嘌呤氧化酶-NBT法中，NBT产物甲臜水溶性差，需要加入助溶剂增加水溶性，因此此法应用有一定的限制。肾上腺素自氧化法和Marklund邻苯三酚法是根据肾上腺素和邻苯三酚在碱性条件下自氧化，产生超氧阴离子和有色物质，根据有色物质的含量变化测定超氧化物歧化酶活性，但是有色物质不稳定，存在时间短，因此测定有误差，重现性较差。化学发光法是通过使用化学发光剂使体系产生化学发光，间接的检测超氧阴离子的方法，该方法由于发光时间短暂，测定困难并易产生误差，重现性较差。

发明内容

本发明为解决现有技术中测定超氧化物歧化酶活性的方法存在检测困难，准确度低，重现性差的技术问题，而提供了一种涉及紫外-可见分光光度法测定超氧化物歧化酶的活性的方法。

为了解决上述技术问题，本发明的测定超氧化物歧化酶活性的方法的技术方案具体如下：

一种测定超氧化物歧化酶活性的方法，该方法包括以下步骤：

步骤a、超氧阴离子产生体系缓冲溶液的配制

配制pH值为8.5 ~9.5的30~50毫摩尔/升的碳酸氢铵缓冲溶液；

步骤b、标准品的配制

用步骤a中的碳酸氢铵缓冲溶液将标准品配成浓度为50微摩尔/升的标准溶液，所述的标准品为2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐；

步骤c、对照品、样品和空白样品的制备

对照品的制备：取40微升0.4~8毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升生理盐水，加入40微升50微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升1毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37℃反应8~20分钟后，作为对照品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；

样品的制备：取40微升0.4~8毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升超氧化物歧化酶溶液，加入40微升50微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升1毫摩尔/升邻苯三酚水溶液，37℃反应8~20分钟后，作为样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；

空白样品的制备：取40微升0.4~8毫摩尔/升乙二胺四乙酸二钠盐，加入40微升超氧化物歧化酶溶液，加入40微升50微摩尔/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐，最后加入40微升水溶液，37℃反应8~20分钟后，作为空白样品，供内置紫外可见分光光度计的酶标仪测定；

步骤d、对照品、样品和空白样品的检测

设定紫外-可见检测波长为450纳米，在内置紫外可见分光光度计的酶标仪中对步骤c中制备的对照品、样品和空白样品进行测定，得到对照品、样品和空白样品的吸光度值A_对照品、A_样品和A_空白样品；

步骤e、超氧化物歧化酶的活性的计算

超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率按照以下公式计算：

I_样品 = [A_对照品 -（A_样品 - A_空白样品）]/ A_对照品 × 100%

式中，I为超氧化物歧化酶对超氧阴离子的清除率；

A_对照品为对照品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑钠盐的产物水溶性甲臜的吸光度值，无量纲；