[发明专利]亲和层析基质及其制备和使用方法

说明书

本申请为申请日为2007年1月5日、申请号为200780001886.X、发明名称为“亲和层析基质及其制备和使用方法”的发明专利申请的分案申请。

本申请要求以2006年1月6日递交的美国临时申请60/756,873号作为优先权，通过引用的方式将其全部内容并入本文。

发明领域

本发明主要涉及层析领域。在一些特定实施方式中本发明提供了涉及亲和层析的基质及方法。

发明背景

层析方法一般用于从混合物中分离和/或纯化目标分子如蛋白质、核酸和多糖。亲和层析具体包括使混合物通过连有特异性配体（即特异性结合配偶体）的基质，以使目标分子结合于其上。通过接触配体，目标分子结合到基质上并因此从混合物中保留下来。相比于其他类型的层析，亲和层析提供了一些优点。它提供了一种高特异性、快速、经济和高产率的纯化方法。

在一个应用中亲和层析可被用于纯化如单克隆抗体的蛋白质。比如IgG亚型抗体可通过结合有A蛋白或G蛋白的基质而得到亲和纯化（Boyle and Reis,1987,Biotechnology 5:697;Hermanson et al.,1992,Immobilized Affinity Ligand Techniques,Academic Press;美国专利公开2006/0134805号）。

连接蛋白质配体的方法过去已被描述，如将A蛋白和G蛋白连接到固体支持物例如层析介质上，参见，例如Hermanson et al.1992,Immobilized Affinity Ligand Techniques,Academic Press;美国专利5,874,165号;3,932,557号;4,772,635号;4,210,723号;5,250,6123号;欧洲专利申请EP 1352957A1,WO 2004/074471。典型地，这种介质是用反应官能团（“活化基团”）如环氧化物（表氯醇）、氰（溴化氰CNBr），N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯（DSC）、醛或活化的羧酸（如N-羟基丁二酰亚胺（NHS）酯、羰基二咪唑（CDI）活化酯）来活化的。这些活化基团能直接连接到基础基质，如CNBr，或者它们也可以是“接头”或间隔分子的一部分，典型地是碳、氧和氮原子的直链，如在接头丁二醇二缩水甘油醚（一种常用的环氧化物偶联剂）中发现的碳和氧的十元链。在偶联条件下再将活化介质与蛋白质配体相平衡。一旦偶联反应完成，彻底洗涤介质。对于A蛋白，通常每毫升介质可负载4-6毫克蛋白质（配体密度），形成IgG的最大静态容量（Qs）为40g/L。蛋白质配体密度决定了静态容量。静态容量给出了能在层析分离中应用的蛋白质容量的上限。一般动态容量或者说负载容量（Qd）在一定的介质中与静态容量相关。

一种适合于连接到琼脂糖支持物上的重组形式的A蛋白也已被描述。重组形式的蛋白质被工程化以具有半胱氨酸末端，参见，例如美国专利6,399,750号;GE Healthcare Product Literature for r-Protein A Sepharose Fast Flow，and Mabselect运用该种重组A蛋白，IgG的静态容量已能达到55-70g/L。然而，应用该种重组A蛋白的一个局限是其必须经基因工程化以包含选择性偶联官能团，由此导致的耗时和昂贵。

另一种将蛋白质配体偶联到固体支持物上的策略是“接头辅助偶联”。接头辅助偶联与以下要详述的配体辅助偶联相反，它的特点是依赖于一个包含了配体（即待纯化靶分子的特异结合配偶体）和有助于将配体偶联到固体支持物上的适当连接官能团的单分子。这种技术包括将官能团（如带电的胺）工程化设计为能偶联目标蛋白质配体的接头或间隔区。这些体系中的接头也含有将蛋白质偶联到接头上的活化基团。接头首先连接到固体支持物，再与蛋白质接触。因此单分子接头同时起着将蛋白质共价连接到基质和非共价地与蛋白质相互作用的功能。这提供了在偶联反应前/中实体的预先连接。这一技术已用于将聚糖偶联到膜表面以进行膜印迹凝胶电泳（美国专利5,543,054号;Charkoudian et al.,1995,Analytical Letters,28:1055）。