[发明专利]一种微紫青霉菌的筛选方法及其应用

权利要求书

1.一种微紫青霉菌的筛选方法，包括：

采集砷污染土壤样品，在实验室内从所述土壤样品中分离出真菌，在固态PGP培养基上将分离出的真菌与浸有不同浓度砷的滤纸片作用，将所述真菌纯化培养后，进行显微镜镜检分析，观察所述真菌在不同浓度砷胁迫下的菌落生长状况，由此筛选出微紫青霉菌。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括：

将所述土壤样品经梯度稀释后涂布于砷含量为400～600mg/L的马丁培养基上分离出真菌；

将分离出的真菌经反复纯化后，挑取少量真菌的菌丝，于不含砷的PGP培养基上利用连续划线法纯化培养3-5天，该过程重复2次；同时，制备显微镜镜检样品，利用电子显微镜观察所述菌丝的体形态以及分生及厚垣孢子萌发，筛选出具有较高抗砷能力的微紫青霉菌的菌株。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，所述马丁培养基的成分包括：葡萄糖、蛋白胨、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、琼脂以及水，各成分的重量比为24∶8∶2∶1∶60∶4000；

所述PGP培养基的成分包括：马铃薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比为60∶8∶1∶400。

4.一种微紫青霉菌对砷的抗性的鉴定方法，包括：

在室内培养条件下测定微紫青霉菌对砷的生物累积与挥发能力，以及在含有不同浓度砷的溶液的培养条件下微紫青霉菌生物量的变化，由此鉴定所述微紫青霉菌对砷的抗性。

5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述在室内培养条件下测定微紫青霉菌对砷的生物累积与挥发能力，具体包括：

配制总砷含量为50mg/L的PGP培养基，在120～125℃下灭菌14～17分钟后，接入0.1ml微紫青霉菌生物量为10⁴cfu/ml的菌悬液，培养温度为24～27℃，转速为138～142rpm，培养5天后，以3800～4200rpm转速进行离心处理8～12分钟，用超纯水反复清洗菌质4次，洗掉残留的培养基，将所述菌质于48～52℃下烘干至恒重，然后对所述菌质称重，用11～13ml体积比为4～6∶1的HNO₃、HClO₄混合液在158～162℃条件下将所述菌质消煮10小时，采用原子荧光测定所述菌质中的总砷含量；将离心出的培养液及清洗所述菌质的超纯水混合后作为上清液采用所述原子荧光测定总砷含量；

以所述菌质中的总砷含量作为微紫青霉菌对砷的生物累积量，用下述公式计算微紫青霉菌对砷的挥发量：微紫青霉菌对砷的挥发量＝配置的总砷含量-所述菌质中的总砷含量-所述上清液中的总砷含量。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，

参照在所述总砷含量为50mg/L的PGP培养基中接入微紫青霉菌的处理，分别以在所述总砷含量为50mg/L的PGP培养基中不接入微紫青霉菌处理以及在PGP培养基中接入微紫青霉菌而不配置砷含量的处理作为对照，对每项处理均重复多次。

7.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，在室内条件下测定在含有不同浓度砷的溶液的培养条件下微紫青霉菌生物量的变化，具体包括：

配制总砷含量范围为0～200mg/L的PGP培养基，在120～122℃温度下灭菌14～16分钟后，将生长速率相同的8～10mm微紫青霉菌菌块分别加入以上处理中，于摇床上温度为23～27℃，转速为138～142rpm振荡培养；培养5天后，培养液以3800～4200rpm离心8～12分钟，并采用稀释梯度法计数菌悬液中的孢子数目，即表达所述微紫青霉菌生物量；

用超纯水反复清洗菌质4次，洗掉残留的培养基后，将所述菌质于48～52℃下烘干至恒重，然后称量所述菌质重量，即所述微紫青霉菌生物量重量。

8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于，

不同的总砷含量的相应的处理均重复多次。

9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括：

观察随着培养溶液中总砷含量的增加所述微紫青霉菌的生物量的变化趋势，并观察所述微紫青霉菌的生物量最高时的总砷含量，由此确定所述微紫青霉菌表现出较强的对砷生物累积与挥发的总砷含量范围。

10.一种微紫青霉菌在砷污染土壤治理以及降低砷在作物及农产品中累积方面的应用。