[发明专利]血液细菌内毒素检测试剂盒的制备和应用

权利要求书

1.一种特异性鲎试剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

A.采血，加入与鲎血的体积比为1:6～1:10的抗凝剂；

B.分离细胞：将鲎血移至离心瓶内，在750-850转/分的速度下离心分离，弃血清；

C.裂解细胞：将步骤B余下的鲎血细胞移至收集瓶内，按鲎血细胞体积的40%-50%的量加入细胞裂解液，裂解细胞得鲎血细胞溶解物；

D.分离细胞壁：按照与鲎血细胞溶解物的体积比为1:0.8～1:1.2的量向鲎血细胞溶解物中加入氯仿，并加入适量聚乙二醇8000，随即混合形成混合溶液，然后离心，分离提取物，制得鲎试剂原液。

E.加入促活剂及G因子抑制剂，配制半成品：按鲎试剂原液体积与促活剂体积比为1:0.15～1:0.30的比例加入预先调配好的促活剂，按照鲎试剂原液体积与G因子抑制剂体积比为1:0.25～1:0.50的比例加入G因子抑制剂，搅匀，制成鲎试剂半成品。

F.灌装、冷冻干燥和封口，制得特异性鲎试剂成品。

2.根据权利要求1所述的特异性鲎试剂的制备方法，其特征在于，步骤A中的抗凝剂是这样配制的：向适量纯化水中加入预配好的辅料溶液，使每100ml溶液中含咖啡因或茶碱0.015M～0.04M，含NaCl0.15M～0.35M。

3.根据权利要求1所述的特异性鲎试剂的制备方法，其特征在于，步骤C中的细胞裂解液是这样配制的：向纯化水中加入0.05M/ml的Tris-HCl溶液，调PH值为6.0～8.0。

4.根据权利要求1所述的特异性鲎试剂的制备方法，其特征在于，步骤D中的聚乙二醇8000在所述混合溶液中的浓度为1.5～3mg/ml。

5.根据权利要求1所述的特异性鲎试剂的制备方法，其特征在于，步骤E中的促活剂是这样配制的：在适量纯化水中加入KCl、MgSO₄或CaCl₂溶液，使每毫升促活剂含KCl 0.15～0.30M，含MgSO₄0.15～0.30M或含CaCl₂0.20～0.40M。

6.根据权利要求1所述的特异性鲎试剂的制备方法，其特征在于，步骤E中的G因子抑制剂是这样配制的：在适量纯化水中加入香菇多糖，使其在每毫升G因子抑制剂溶液中的含量为15mg～30mg。

7.一种采用权利要求1~6任一项所述的特异性鲎试剂的制备方法制备的特异性鲎试剂。

8.一种血液细菌内毒素检测试剂盒，其特征在于，其组成包括权利要求7所述的特异性鲎试剂、体液处理剂I号、体液处理剂Ⅱ号、细菌内毒素质控品和检查用水；

所述体液处理剂Ⅰ号是这样配制的：分别称取适量氯化钠、缓血酸铵，用适量水溶解，使每毫升溶液含氯化钠8.5mg～15mg，含缓血酸铵0.5～1mg，之后调节PH值为5.5～7.5；

所述体液处理剂Ⅱ号是这样配制的：称取适量缓血酸铵，用适量水溶解，使每毫升溶液中含缓血酸铵0.2mg～0.5mg，之后调节PH值为6.5～8.0。

9.一种血液中细菌内毒素的检测方法，其特征在于，该检测方法采用权利要求7所述的特异性鲎试剂或权利要求8所述的血液细菌内毒素检测试剂盒测定血液样本中的细菌内毒素。

10.根据权利要求9所述的血液中细菌内毒素的检测方法，其特征在于，用所述特异性鲎试剂或所述血液细菌内毒素检测试剂盒检测血液样本中的细菌内毒素时，检测样本按如下步骤制备：

①取血液样本，按1：1的体积量加入体液处理剂Ⅰ号溶液，混匀15秒钟-30秒钟，2000转/分～4500转/分，离心2～10分钟，取上清液，即为血液样本2倍稀释液；

②取2倍稀释液，按1:1的体积量加入体液处理剂Ⅱ号溶液，混匀15秒钟-30秒钟，移至70～90℃条件下水浴加热5分钟～10分钟，恒温结束，在2000转/分～4500转/分，离心2～10分钟，制得4倍稀释液备用；

③取4倍稀释液的上清液，按体积比1：1加入检查用水，混匀，制得8倍稀释液，即检测样本。