[发明专利]全人源抗CD33单链抗体ZJL101及其应用

说明书

技术领域

本发明属基因工程，涉及全人源抗CD33单链抗体的筛选、鉴定和原核表达，及其在CD33阳性白血病靶向药物制备中的应用。 

背景技术

噬菌体展示抗体技术可以制备全人源的抗体，是将蛋白分子或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA中，与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白，从而使异源分子展示于噬菌体表面。主要特点是将特定的分子的基因型和表达型同时出现在一个噬菌体颗粒内，通过DNA测序可以获得特定展示蛋白的序列信息。 

噬菌体抗体库技术模拟了人类B细胞的分化成熟过程，首先通过分子生物学手段将人类抗体的重链和轻链可变区基因连接起来形成单链抗体(Single-chain variable fragment, scFv)，插入噬菌体载体上，使单链抗体scFv展示在噬菌体表面，再用特定的抗原筛选出特异性的噬菌体抗体，并用大肠杆菌表达可以表达大量单链抗体。 

噬菌体可以表达抗体结合片段(Fragment antigen binding, Fab)、单链抗体(scFv)、双链抗体(Diabody)和双特异性抗体(Bispecific scFv, BsAb)等。其中单链抗体(scFv)是目前报道最多的一种小分子抗体，是由抗体识别抗原的可变区Fv段组成。Fv由重链可变区V_H和轻链可变区VL通过连接肽（linker）连接构成scFv。所加的linker很重要，必须不影响Fv的构象，目前最常用的是由四个甘氨酸和一个丝氨酸组成的重复3次的序列(GGGGS)₃。将scFv基因克隆在丝状噬菌体载体pIII基因先导序列和pIII基因之间，以融合蛋白的形式被导入细菌膜间隙，并组装成scFv，在加入辅助噬菌体M13K07后，scFv以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面。pCANTAB-5E载体的特点是，在scFv基因后面含有一段编码Tag尾肽(E-Tag)的序列，在E-Tag后面有一个琥珀(Amber)终止密码，位于scFv基因与pIII基因之间，在抑制性细菌TG1中，这种琥珀密码子只有20%有效，所以在蛋白翻译过程中可以被通读而形成scFv-pIII融合蛋白；而在非抑制性菌株中，如HB2151，此终止子被识别，同时scFv基因在pIII基因前终止，形成独立的抗体蛋白，滞留于细胞膜间隙，并在长时间培养后释放于培养液中，形成可溶性表达。另外，用分子克隆的方法，也可以将scFv基因转移进入pET表达体系，并在大肠杆菌中实现高表达而获得单链抗体。 

 单链抗体具有结构简单、相对分子量小、穿透性强、免疫源性低等优点，是一种理想的载体。构建全人源抗体库目的是寻找一种能与特定白血病相关抗原（如CD33等）特异性结合的单链抗体scFv，这类特异识别肿瘤细胞的单链抗体本身或者经过基因工程改造成其它的抗体形式后，可以作为抗肿瘤药物进行开发；其次可以作为药物载体，如偶联药物、毒素或放射性同位素，进行白血病的靶向治疗。 

发明内容

本发明的目的是提供一种全人源抗CD33单链抗体ZJL101，具有结构简单、相对分子量小、穿透性强、免疫源性低等优点，是一种理想的药物运输载体。SEQ ID NO 1是该单链抗体的DNA序列： 

atggcccagg tccagcttgt gcagtctggg actgtagtga agaagcctgg gtcctcggtg 

aaggtctcct gcaagacttc tggaggcacc ctccccaacc atgccatcaa ctgggtgcga 

caggcctctg gacaagggct tgagtggatg ggatggatga gccctaacac tggtgacaca 

ggctatgcac ggaagttcca gggcagagtc accatgacca gggacacctc cataagcaca 

gcctacatgg aactgagcag cctgagatct gacgacacgg ccatatatta ctgtgcgacg 

ggcgaccccc gggttggtca ttcgtggggc cagggcaccc tggtcactgt ctcctcaggt 

ggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt ggtggtggat ctgacatcca gatgacccag 

tctccaccct ccctgtctgc atctgtagga gacagagtca ccatcacttg ccgggcaagt