[发明专利]一种重组亮氨酸氨肽酶的分离纯化方法

权利要求书

1.一种重组亮氨酸氨肽酶的分离纯化方法，是采用阴离子交换柱分离纯化重组亮氨酸氨肽酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换柱是Hiprep DEAE 16/10Fast Flow。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亮氨酸氨肽酶由重组枯草芽孢杆菌分泌表达。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌构建方法：将编码成熟氨肽酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1连接大肠-枯草穿梭载体PMA5后转化枯草芽孢杆菌WB600，获得重组枯草芽孢杆菌。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌的表达培养基为1.2％胰蛋白胨，2.4％酵母提取物，0.4％甘油，17mM KH₂PO4，72mM K₂HPO4。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌表达条件为37℃，200rpm培养32h。

7.权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤如下：

1)将发酵液离心去除菌体，收集发酵上清液；

2)将发酵上清液经过硫酸铵分级沉淀，收集的蛋白沉淀溶解后进行透析；

3)将透析后的酶液加入到用pH 8.5的Tris-HCl缓冲液平衡好的阴离子交换柱Hiprep DEAE 16/10Fast Flow中，用含氯化钠pH 8.5的Tris-HCl缓冲液线性梯度洗脱，收集活性部分。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述用于洗脱的含氯化钠的Tris-HCl缓冲液，流速2.5ml/min，线性范围为0-0.6mol/L，洗脱柱体积为4个。