[发明专利]骨骼肌特异性表达PEPCK-C以改变小鼠运动能力和代谢功能的转基因载体

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种骨骼肌特异性表达PEPCK-C以改变小鼠运动能力和代谢功能的转基因载体。

背景技术

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK）是催化糖异生(gluconeogenesis)反应的一个限速酶，即由草酰乙酸和GTP转变为磷酸烯醇式丙酮酸、GDP及CO2的反应。目前已知有两种PEPCK同工酶，分别是PEPCK-M（mitochondrial form）和PEPCK-C(cytosolic form)，PEPCK-C（也叫PCK1）在糖异生中有重要作用，对其研究也更多。目前PEPCK-C已成为肝脏糖异生的一明确的标记物，肝脏中此基因的转录水平成为临床上2型糖尿病评价的重要指标，即如果PEPCK-C的mRNA表达增加，糖异生的速率就一定会增加。PEPCK-C基因编码了一个63kDa的蛋白酶，主要在肝脏和肾皮质中表达，并催化糖异生反应；在肝脏以及白色和棕色脂肪组织中，PEPCK-C还参与甘油异生反应(glyceroneogenesis)；此外，PEPCK-C在流失反应(cataplerosis)中起作用，以去除柠檬酸循环中的阴离子；PEPCK-C酶同时还广泛存在于哺乳动物的组织内，包括小肠、结肠、乳腺、肾上腺、肺和肌肉。但是其在这些组织中的代谢作用仍未明确。

PEPCK-C在不同组织中的活性是在转录水平上调控的。例如，在肝脏中特异表达PEPCK-C基因只需要从-460bp到+69bp的启动子序列，营养物质和荷尔蒙可调控PEPCK-C基因的转录水平，cAMP、糖皮质激素和胰岛素都能调节PEPCK-C基因的转录，并已确定了它们在PEPCK-C启动子上的相对应的调控序列。

由于PEPCK-C在不同组织中的主要功能不同，所以不同的组织特异性的基因敲除或过表达引起多种不同的表型。正常情况下，PEPCK-C在骨骼肌中不表达或表达量很低。PEPCK-C用6个ATP的能量来催化丙酮酸转变为一个葡萄糖，而在骨骼肌中的无氧酵解每分解一个葡萄糖，却只能生成2个ATP。我们预期在骨骼肌中过度表达PEPCK-C，血液中的甘油三酯和游离脂肪酸可能都会向骨骼肌运输，提供更多的能量，并可能影响机体的代谢水平。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能在骨骼肌中特异性表达PEPCK-C以改变小鼠运动能力和代谢功能的转基因载体。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种能在骨骼肌中特异性表达PEPCK-C的转基因片段包含小鼠的α-骨骼肌肌动蛋白（α-skeletal actin）基因的启动子、小鼠PEPCK-C的cDNA和牛生长激素基因（bGH）的3’端不翻译区域，且带有哺乳动物细胞中筛选用的抗性基因—嘌呤霉素（Puromycin）基因和原核细胞中筛选用的抗性基因—氨苄青霉素（ampicillin）基因（见图2）。

3.3kb的小鼠α-骨骼肌肌动蛋白（α-skeletal actin）启动子可保证下游的基因在骨骼肌中特异性表达。

本发明构建的骨骼肌特异表达鼠PEPCK-C的转基因载体的全序列如SEQ ID No：1所示，其中228-3525碱基为α-骨骼肌肌动蛋白（α-skeletal actin）基因的启动子区，第3604-5472碱基为鼠PEPCK-C编码区，第6386-6610碱基为bGH 3’端不翻译区，第6693-7292碱基为嘌呤霉素（Puromycin）抗性基因，第9337-10336碱基为氨苄青霉素（Ampicillin）抗性基因。

本发明的转基因载体可用于体细胞克隆，以构建能够改变小鼠运动能力和代谢功能的PEPCK-C转基因小鼠。

附图说明

图1是本发明的技术流程图。

图2是本发明构建的pST229转基因载体的示意图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。