[发明专利]一种肺癌骨转移荧光定量PCR检测试剂盒

权利要求书

1.一种novel_mir_54的反转录引物，其特征在于，所述的反转录引物其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.一种novel_mir_54的特异性引物和特异性探针，其特征在于，所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，所述的特异性探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。

3.一种检测肺癌骨转移的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求2所述的特异性引物和特异性探针。

4.根据权利要求3所述的一种检测肺癌骨转移的荧光定量PCR试剂盒，还包括：标准DNA模板、Hot-start Taq DNA聚合酶，其浓度为2.5U/μl，Hot-start Taq DNA聚合酶的10×buffer，dNTP混合物，每种NTP浓度为10mmol/L。

5.一种肺癌骨转移的检测方法，包括样品miRNA的提取、样品cDNA的制备、novel_mir_54的扩增。

6.根据权利要求4中所述的样品miRNA的提取、样品cDNA的制备、novel_mir_54前体的扩增的具体步骤包括：

1)样品miRNA的提取：按Trizol法提取肺癌骨转移的肿瘤细胞总RNA，从总RNA中纯化miRNA；

2)样品cDNA的制备：将提取的RNA的反转录为cDNA，反转录体系为：反转录引物RT54SEQ ID NO.1(2μmol/L)1μl，细胞总RNA4μl，dNTP混合物(每种2.5mmol/L)4μl，0.1mol/L DTT2μl，SuperScript RNase H逆转录酶(200U/μl)2μl(购自Invitrogen公司)反应条件为：37℃水浴60分钟，95。℃3分钟；

3)novel_mir_54的扩增：以反转录的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。其中cDNA模板300ng，Hot-start Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)1μl，Hot-start Taq DNA聚合酶的10×buffer7μl，dNTP混合物1μl，特异性引物SEQ IDNO.2，下游引物SEQ ID NO.3，荧光探针引物Flu541μl，去离子水补齐 至50μl。荧光定量PCR程序为：95℃10min预变性，接45个循环：95℃40s，60℃1min。

7.权利要求1的引物和探针在制备检测肺癌骨转移试剂盒中的应用。