[发明专利]碱性蛋白酶法从肠粘膜提取高纯肝素钠的工艺

说明书

技术领域

本发明涉及肝素钠生产技术领域，特别涉及一种碱性蛋白酶法从肠粘膜提取高纯肝素钠的工艺。

背景技术

肝素钠又称肝素，是一种含有硫酸基的酸性粘多糖类天然抗凝血物质。肝素钠为白色或类白色粉末，无臭无味，有引湿性，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、二氧六环等有机溶剂。

肝素钠广泛存在于哺乳动物肝、肺、肠黏膜中，多与蛋白质结合成复合体存在。酶解蛋白可分离肝素钠，肝素钠是含硫酸、氨基、醛糖酸的粘多糖。在pH8-9时，带负电荷，可与阴离子交换剂进行离子交换，进行粗分离，多糖液在高浓度乙醇中沉淀进行精纯。       肝素钠是血液化学成分测定中最好的抗凝剂。肝素钠是一种含硫酸基团的黏多糖，分子量为1.5万，其抗凝机制是与抗凝酶Ⅱ一起，在低浓度能抑制因子Ⅸa、Ⅷ和PF3之间的作用，并能加强抗凝血酶Ⅲ灭活丝氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶形成；还有抑制凝血酶的自我催化及抑制因子X的作用。

传统的肝素钠的酶解生产方法的缺陷是：生产周期长，能耗大，收率低，生产一亿国际单位肝素钠粗品需2800-3000根猪小肠，产品纯度低，肝素钠的效价至多为80U/mg，并产生大量的肠渣和废水，污染环境。CN1308088A的发明公开了一种利用生物发酵工艺生产肝素钠的方法。该方法采用2709蛋白酶作为催化剂，D204强碱性阴离子交换树脂作为离子交换树脂，并采用150-180目多层布筛进行过滤。该方法存在的缺陷是：产品收率、纯度也较低，并产生大量的肠渣和废水，污染环境。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种碱性蛋白酶法从肠粘膜提取高纯肝素钠的工艺，生产周期短，产品收率、纯度高，减少了肠渣和废水的排放，利于环保。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

一种碱性蛋白酶法从肠粘膜提取高纯肝素钠的工艺，所述的工艺步骤如下：

（1）酶解：将猪小肠粘膜浆液加入酶解罐，猪小肠粘膜浆液为猪小肠粘膜：水=1: 2.5-4的重量比的混合物，向酶解罐中加入盐度21°-24°的氯化钠溶液调节酶解罐中料液的盐度至5±0.5°，控制料液的pH在8.5±0.5；接着按每1000L料液加1.2±0.4kg的酶量向酶解罐内加入2709碱性蛋白酶，控制料液温度在53±3℃，盐度4.2±0.2°，pH 7.0±0.5保持3±0.5小时；最后升温至85-88℃，保持20-25min得酶解液，过滤去残渣。本步骤最后酶解液过滤去残渣时，往往采用布袋过滤去残渣，这样效率往往较低，发明人通过实践探索，发明了采用振动筛过滤去残渣的方式，大大提高了过滤速度，提高了生产效率，是代替布袋过滤的好方法。

（2）吸附：将酶解液输入吸附罐，降温至57±3℃，加水调节盐度至3.0±0.5°，控制pH 7.0-7.5，按每1000L酶解液加3-8kg的树脂量，向吸附罐内加入罗门哈斯FPA98CL型树脂，搅拌吸附6-8小时后，收集树脂。

（3）洗涤：将收集的树脂用水洗涤至pH为中性，再将树脂放入盐度4±1°、温度55-60℃的氯化钠溶液，搅拌至少1小时进行洗涤，其中，树脂：氯化钠溶液=1:1.3-1.7（w/v）；控制氯化钠溶液温度在55-60℃，便于将树脂表面油脂类的附着物清洗干净，便于洗脱。

（4）洗脱：将步骤（3）洗涤后的树脂倒入洗脱罐中进行两次洗脱，其中，第一次洗脱为：将树脂加入到盐度为21±1°、温度55-60℃的氯化钠溶液中搅拌至少3小时，树脂：氯化钠溶液=1:1-1.4（w/v）；第二次洗脱为：将第一次洗脱后的树脂加入到盐度为21±1°、温度55-60℃的氯化钠溶液中搅拌至少3小时，树脂：氯化钠溶液=1:0.8-1.2（w/v）；合并两次收集的洗脱液；控制两次洗脱洗脱时的氯化钠溶液温度在55-60℃，便于将油脂状的肝素钠从树脂上洗脱下来，增加得率。

（5）沉淀：将步骤（4）收集到的洗脱液倒入沉淀罐中，搅拌条件下向沉淀罐中加入酒精度85±5°的酒精，酒精用量以实测沉淀罐中混合液的酒精度到45°-60°为准，静置沉淀15小时以上，收集沉淀物。

（6）重溶再沉淀：将沉淀物：水=1:8-10的重量比混合，充分溶解形成沉淀物溶液，向沉淀物溶液中加入肠衣专用盐，搅拌均匀，肠衣专用盐的用量为沉淀物溶液质量的1-3%；再加入酒精度85±5°的酒精再次沉淀，酒精用量以实测沉淀罐中混合液的酒精度到45°-60°为准，静置沉淀15小时以上，收集沉淀物。