[发明专利]定性检测人类BRAF V600E基因突变的测序引物对及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及体外核酸检测领域，尤其涉及一种在临床样本中区分人类BRAF V600E基因突变的测序引物对及其试剂盒。 

背景技术

BRAF基因全名为人源鼠肉瘤病毒（v-raf）致癌同源体B1（v-raf mourine sarcoma viral oncogene homolog B1，B-raf），其编码的B型有丝分裂原激活的蛋白激酶依赖性激酶的激酶（RAF）是RAS/RAF/MEK/MARK信号通路的关键成分，该信号通路调节细胞的生长、增值和凋亡，当其发生改变时则可能导致肿瘤的形成。BRAF错义突变发生于近8％人类肿瘤中，主要发生在结直肠癌、黑色素瘤和甲状腺乳头状癌中。多种消化道肿瘤中均存在不同频率的BRAF基因突变。因此，该突变可作为一个诊断和预后的分子生物学标记及开发治疗相关癌症的基因靶点。 

BRAF基因包括3个保守区域，称为CR1、CR2和CR3。CR3为激酶区域。大多数的BRAF突变主要发生外显子15上的激活区，其中约92%位于第1799核苷酸上，T突变为A，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代（V600E(1799T>A)）。而V600E突变正好位于BRAF基因的活性区域（CR3）上。目前认为，这一突变带来的负电荷模拟了苏氨酸598和丝氨酸601的磷酸酰基化过程，从而异常激活了BRAF基因。BRAF V600E突变对下游激酶的激活能力是野生型的12.5倍。 

在同一肿瘤中，BRAF突变和Kras突变几乎不同时出现。BRAF蛋白可能独立于RAS蛋白而发挥作用。因此，2010年版《NCCN结直肠癌临床实践指南》建议在使用西妥昔单抗前，对野生型KRAS患者进行BRAF基因（V600E）突变检测，能筛除约50%的非适用人群，以提高用药的针对性。 

目前医院用于BRAF V600E基因分型检测的“金标准”是PCR-直接测序法,但直接测序法的敏感性不高，只能检测出突变细胞比率在10-20%以上的肿瘤组织，对于含<10%突变细胞的肿瘤组织以及外周血，常规PCR+直接测序法几乎 无能为力。相比于直接测序法，焦磷酸测序的灵敏性更高、成本更低。 

焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基于聚合原理的DNA测序（确定DNA中核苷酸的顺序）方法，是新一代DNA序列分析技术。它是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。通过分析岀峰情况，达到测定DNA序列的目的 

目前市场上还没有利用焦磷酸技术进行BRAF V600E的基因多态性检测的产品。 

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性高、准确性好、能够定性检测人类BRAF V600E基因突变的测序引物对及其试剂盒。 

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为： 

一种定性检测人类BRAF V600E基因突变的测序引物对，所述引物对为如下引物： 

正向扩增引物：5′-CTTCATAATGCTTGCTCTGATAGG-3′（SEQ ID NO.1） 

反向扩增引物：5′-GCATCTCAGGGCCAAAAATT-3′（SEQ ID NO.2）； 

测序引物：5′-CCACTCCATCGAGATT-3′（SEQ ID NO.3）； 

其中，正向扩增引物的5′端进行了生物素标记。 

一种定性检测人类BRAF V600E基因突变的测序试剂盒，所述试剂盒中包括含有SEQ ID NO.1所示引物的PCR反应液，SEQ ID NO.2所示的反向扩增引物，SEQ ID NO.3所示的测序引物；其中，SEQ ID NO.1所示引物的5’端进行生物素标记。 

进一步地，所述试剂盒还包括BRAF阳性对照品；所述BRAF阳性对照品包含BRAF阳性对照品1和BRAF阳性对照品2；所述BRAF阳性对照品1为插有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的野生纯合子质粒；所述对照品2为所述野生纯合子质粒与插有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的突变纯合子质粒组成的质粒混合物；其中，质粒载体为pMD18-T质粒；所述质粒混合物中，野生纯合子质粒与突变纯合子质粒的数量比为1:1。