[发明专利]百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法

说明书

技术领域

本发明涉及超低温保存领域，具体涉及一种百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法。

背景技术

百子莲（Agapanthus praecox ssp.orientalis）又称‘蓝百合’，为多年生根茎类花卉，原产非洲南部地区。百子莲叶形秀丽，花朵姿态优美，花色淡雅，花期持续时间长，具备抗逆性强，观赏性强的特点，从其叶片及根茎的药用成分利用到花的观赏，从庭院栽培到切花生产，拥有较高的观赏价值及应用价值，是西方发达国家高档鲜切花、盆花和沿海公园地被材料，也是除玫瑰花之外最能表达爱意的爱情花。为了快速繁殖引进的优良种质资源，需要开展百子莲优良种质资源无性扩繁技术研究。但发现百子莲胚性愈伤组织增殖速率在继代3周左右达到最大，以后开始逐渐下降。为维持较高的细胞增殖速率，必须每隔2～3周继代一次，但长时间连续继代在高浓度激素增殖培养基上会引起细胞胚性丧失或胚胎败育等问题。而胚性细胞长时间继代培养引起胚性丧失是植物体细胞胚胎发生中普遍存在的一个问题。重复启动胚性愈伤组织诱导不仅费时、费力、费钱，还有可能引起体细胞变异，无法为新品种的培育提供充分的材料。因此，研究建立一套细胞存活率高、遗传性稳定的百子莲胚性愈伤组织超低温保存技术体系是亟待解决的技术问题。

超低温保存（Cryopreservation）是上世纪70年代发展起来的一项现代种质资源离体保存技术。通常在液氮中保存，被保存材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，处在相对稳定的生物学状态，达到长期保存种质的目的，超低温保存是目前唯一不需要连续继代的中长期保存方式。玻璃化法（Vitrification）超低温保存是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下固化成非结晶的玻璃化态，并以这种玻璃态在低温下保存。该方法具有简便、成本低、保存材料遗传性稳定等优点。国内外先后对200多种植物的不同外植体进行了超低温保存技术研究，但有些植物（如热带植物或者含水量高的植物）恢复培养后成活率不高或根本不能成活，百子莲属于热带植物，其胚性愈伤组织含水量较高，是较难保存的植物材料，百子莲超低温保存技术也尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有无性扩繁技术的不足，提供一种百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法，用于百子莲种质资源的保存，为体细胞胚发生成苗以及新品种培育材料供给提供了一条有效途径，将对热带及含水量较高的植物资源的保存以及无性扩繁技术体系的完善起到指导作用。

本发明首先公开了一种百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法，为对百子莲胚性愈伤组织进行低温-高渗预处理后，依次置于装载液和玻璃化溶液中进行脱水处理，最后将脱水处理后的胚性愈伤组织重新加入新的玻璃化溶液并迅速投入液氮中进行保存。

较优的，所述百子莲胚性愈伤组织玻璃化超低温保存方法具体步骤如下：

1）低温-高渗预处理：将百子莲胚性愈伤组织置于预处理培养基中，4℃培养；

2）脱水处理：将步骤1）预处理后的百子莲胚性愈伤组织置于装载液内脱水处理后，吸除表面的装载液，再置于玻璃化溶液中，于0℃进一步脱水处理；

3）液氮保存：除去步骤2）进一步脱水处理所使用的玻璃化溶液，重新添加新的玻璃化溶液后，迅速转入液氮中进行保存。

较优的，步骤1）所述百子莲胚性愈伤组织是指：继代培养20d，易碎、松散的百子莲胚性愈伤组织。

更优的，所述继代培养的培养基为含有1～1.5mg/L毒莠定的MS固体培养基。

较优的，步骤1）所述预处理培养基是蔗糖含量为0.3～0.7M的MS固体培养基；预处理的培养时间为1～5d。

更优的，步骤1）所述预处理培养基为含有0.5M蔗糖的MS固体培养基；预处理的培养时间为2d。

步骤1）所使用的预处理培养基的其他成分与MS固体培养基相同，仅将MS固体培养基中3wt%的蔗糖含量替换为0.3～0.7M的蔗糖含量。

较优的，步骤2）所述装载液为含有2M丙三醇、0.4M蔗糖、10mM KN0₃的MS培养液。

较优的，步骤2）所述玻璃化溶液为含有30wt%丙三醇、15wt%乙二醇、15wt%二甲基亚砜、0.4M蔗糖的MS培养液。

较优的，步骤2）装载液脱水处理的时间为20～80min，玻璃化溶液脱水处理的时间为20～80min。

更优的，步骤2）装载液脱水处理的时间为60min，玻璃化溶液脱水处理的时间为40min。