[发明专利]一种产葡萄糖氧化酶酵母工程菌及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种产葡萄糖氧化酶的基因工程菌，特别是一种产葡萄糖氧化酶的酵母工程菌，属于基因工程技术领域。 

背景技术

葡萄糖氧化酶（GOD）是生物领域中最主要的工具酶之一。自1967年Updike和Hicks将GOD固定在Clark氧电极表面，将其应用于血糖测定以来，GOD被广泛应用于食品、饲料、医药等许多相关领域。 

在食品工业中，由于氧的存在，引起许多不利于产品质量的化学反应，并为许多微生物生长创造了条件。目前，许多国家已将GOD作为工人的安全抗氧剂而广泛应用于各种食品和食品加工工艺中。虽然用途多样，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成过氧化氢、形成葡萄糖酸四个方面。利用其专一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析仪，能快速准确简易地测定各种食品中的葡萄糖含量，指导生产。 

在医药工业中，GOD作为试剂盒、酶电极等用于血清(浆)、尿液及脑脊液中葡萄糖的体外定量分析;GOD制成的酶制剂还可用于除去或缓解牙斑、牙垢和龋齿的形成防止口腔疾病和牙病的发生。此外，由于可以催化生成H₂O₂，还可用于对H₂O₂敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗。 

GOD还是一种新型的酶饲料添加剂，能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。含葡萄糖氧化酶、乳酸过氧化物和乳铁蛋白的混合饲料添加剂，可用于预防牲畜胃肠道感染、腹泻，并有促进动物生长作用。 

从动植物组织中提取GOD有一定的局限，酶量亦不丰富；细菌GOD产酶量少；一般采用黑曲霉（具有GRAS资格）和青霉属菌株作为GOD生产菌。我国及美国均采用点青霉及产黄青霉生产GOD，日本常用尼崎青霉，俄罗斯用生机青霉，近年报道胶霉属（Clioctadium）、拟青霉属（Paecilomyces）和帚霉属（Scopulariopsis）也能生产GOD。 

产量低、酶活低、检测方法复杂是GOD产业化的限制性因素，国内外为此做了大量工作并取得了明显进展。目前国外生产的GOD厂家主要是德国的Boehringer和日本的TOYOBO。规模化生产高活性的GOD还有困难。发酵生产GOD的同时产生大量杂蛋白，分离提取复杂，成本高。 

发明内容

本发明提供了一株组成型产葡萄糖氧化酶的基因工程菌，于2012年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉、武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2012267，分类学命名为毕赤酵母(Pichia pastoris)X33-pGAPZα-GOX。 

本发明还提供了一株产葡萄糖氧化酶基因工程菌的构建方法，包括如下步骤： 

1）根据本实验室筛选保藏的黑曲霉CCTCC NO：M2011291的基因为模版设计引物，获得GOD基因； 

2）将GOD基因连接到毕赤酵母表达载体pGAPZα，得到重组质粒pGAPZα-GOD； 

3）重组载体转化Pichia pastoris X33。 

葡萄糖氧化酶酶活测定方法：GOD活性测定一般采用邻-联(二)茴香胺分光光度法。在有氧条件下，GOD催化葡萄糖脱氢产生H₂O₂，在过氧化物酶（POD）作用下，氧供体邻-联(二)茴香胺（DH₂）被氧化成棕色产物。测540nm处吸光度的变化，根据标准曲线的结果，计算葡萄糖氧化酶活力单位。 

本发明的有益效果：该菌株表达的葡萄糖氧化酶在摇瓶中的酶活为23U/mL，比野生菌的酶活提高了近11倍，大大降低了生产成本，在工业上具有重大应用价值。 

生物材料保藏 

一种产葡萄糖氧化酶的酵母工程菌，该菌株为巴斯德毕赤酵母，命名为Pichia pastoris X33-pPIC9K-GOX，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2012267，保藏日期为2012年7月1日。 

附图说明

图1：克隆表达载体构建图。 

图2：蛋白电泳（SDS-PAGE）实验结果。M：蛋白质分子量标准(Protein Molecular Weight Marker)；泳道24h-144h：重组毕赤酵母发酵上清液随时间变化的电泳分析。 

具体实施方式

实施例1 重组菌的构建及鉴定