[发明专利]一种间充质干细胞无血清培养基

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，特别涉及一种间充质干细胞无血清培养基。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是属于中胚层的一类多能干细胞，具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，还具有分化为肌细胞、肝细胞、造血细胞、神经细胞、胰岛细胞等多种细胞的能力。MSC来源广泛，易于分离、培养、扩增和纯化，免疫原性低，无道德伦理问题的限制、所以在组织工程、基因治疗和免疫治疗方面有着巨大的应用前景。

MSC在组织中的比例极低，通过体外分离获取的MSC数量非常有限，远远无法满足临床和研究的需求。非分化性增殖，即在保持MSC的多向分化潜能和未分化状态的同时又能快速有效地增殖，成了目前急需解决的问题。

目前国内外实验室和临床研究的EPC的扩增体系，主要是基础培养基添加一定浓度的胎牛血清（FBS）。FBS中含有异种蛋白质，它本身有携带细菌、病毒、蛋白传染性疾病或朊病毒的风险。另外，有研究表明MSC在培养过程中可以吞噬培养基中的蛋白，内含有牛血清蛋白，可以使受者体内产生抗牛蛋白抗体引起免疫反应，从而导致患者尤其在重复输注干细胞治疗后治疗失效。因此FBS在干细胞临床大规模培养中的不利因素已经逐渐暴露出来，现已有很多学者研究FBS的替代品。一些临床研究使用商用血清替代物Ultroser G(Pall BioSepra)，这种培养基含有多种生长因子、结合蛋白、维生素和激素，能较好地满足MSC生长的需要，然而Ultroser G仍然还有一些动物源成分。目前人们使用较多的是应用人血清或血清衍生物来替代。包括成人血清、血小板衍生物(血小板裂解液、凝血酶激活血小板释放因子)、脐血清等。这些成份虽然来源于人，输注人体内不会引起异种蛋白的免疫，但这些人源成分化学成分不明确，不利于进行MSC的深入研究，而且这些成分会将一些人源的一些潜在带入细胞。更关键在于目前人血清、血小板资源少，无法保证MSC的大规模培养。

当前也有一些公司开发的新一代无血清培养基．如Invitrogen开发MSC SFM XenoFree无血清培养基、加拿大stemcell公司开发了MesenCultTM-XF Medium无血清培养基、BD公司开发的BDMOSAICTM Hmsc SF Medium和CellGenix开发的Serum-free MSC Medium等。但这些培养基价格昂贵，在培养MSC过程中都需要使用附属产品进行细胞培养瓶的包被处理，且有可能在明胶包被的过程中引入动物源成分，而且这也增加了工作量和污染的机会，而且一些研究者在使用这些产品时发现并不支持MSC的原代培养或者在原代培养的过程中需要添加2%血清(Hudson JE,Mills RJ,Frith JE,et al.A defined medium and substrate for expansion of human mesenchymal stromal cell progenitors that enriches for osteo-and chondrogenic precursors.Stem Cells Dev.2011;20:77-87.)。而且这些产品在使用过程中需要有高的细胞接种密度要求，在低密度细胞接种时这些培养基无法使用（见表1）。

表1市场上的MSC无血清培养基

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种无血清培养基，其化学成分明确，无动物源，无血清，支持MSC的原代培养，并且可以在低密度接种进行传代培养。

本发明提供的一种无血清培养基，其必要组分为IMDM 17.7g/L、L-谷氨酰胺1-5mM、碳酸氢钠3.024g/L、Hepes  1-5mM、重组人胰岛素1-10mg/L、重组人转铁蛋白5-20mg/L、重组人白蛋白4-10g/L、2-巯基乙醇55nM、原儿茶酸1-5mmol/L、脂质0.1-1mg/L、氨基酸1-10g/L、维生素1-10mg/L、微量元素1-5mg/L、100-500mg/L、氢化可的松1-50ng/ml、维生素C 1-50mg/L、粘接胺或重组人纤连蛋白1-5mg/L、黄体酮10-20ng/ml、腐胺1-10mg/L、肝素1-10IU/mL、血清素1-5mg/L、EGF 1-10ng/ml、b-FGF 1-10ng/ml、PDGF-BB 1-10ng/ml、IGF-I 1-10ng/ml。