[发明专利]miRNA 320a在前列腺癌血清学诊断试剂盒中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种微小RNA（micro RA，miRNA，miR）320a在前列腺癌血清学诊断试剂盒中的应用。属于生物医学材料技术领域。 

背景技术

前列腺癌（prostate carcinoma,PCa）为欧美国家男性常见恶性肿瘤和主要死亡原因之 

随着我国人均寿命延长和生活方式的西化，PCa发病率呈逐年增加趋势，它被列为中国21世纪增长最快的肿瘤之一。本项目在前期工作中筛选出的19个在前列腺癌组织中表达上调的miRNAs序列的基础上，进一步检测其在临床血清样本中的含量，寻找人前列腺癌转移患者的血清学生物标志物。 

目前前列腺癌诊断指标的研究工作主要集中在以下几个方面：(I) PSA亚型和其它的激肽释放酶(如血清KLK2)；(II)DNA生物标志物,包括一些表观遗传学生物标志物(如GSTPi甲基化),基因融合(如TMPRSS2:ERG融合)和杂合性缺失等;(III)RA生物标志物,如非编码的前列腺特异的RA PCA3（曾被称为DD3）和α-甲基酰基辅酶A消旋酶（Alpha-methylacyl CoA racemase，AMACR)mRA在前列腺癌中的表达；(IV)蛋白分子标志物，如PSA，前列腺特异膜抗原(prostate-specifc membrane antigen，PSMA),前列腺干细胞抗原(prostatestem cell antigen，PSCA)等。尽管许多候选的生物学标志物在不断地被发现,尚无新的指标和方法应用于临床检测。 

miRAs是一种新的不编码蛋白的内源性小RAs，它们通过抑制蛋白质翻译过程在细胞增殖、凋亡以及分化等生物学功能方面发挥着重要的调控作用。通过miRAs微列阵、Northern blot和实时PCR等手段，在多种类型人肿瘤中已经发现了一些miRAs表达上调和下调的现象。有研究报道了miRA在乳腺癌和肝癌转移中发挥了重要的作用。近年研究发现，人血浆和血清中存在其它组织来源的miRNAs，它们可以以一种可抵抗内源性RA酶活性的形式存在。测定血浆或血清中肿瘤来源miRNAs的含量可以作为肿瘤检测的手段之一。近年有研究者报道从血清和其它一些体液中miRA的水平可以诊断一些处于早期的疾病。2008年Mitchell报道，miR-141在前列腺癌组患者血清中比对照组高46倍，而且其灵敏度为60%，特异性为100%。对于血清中miRAs的深入研究可为寻找疾病生物标志物提供新的独特视角。 

有研究报道，miR-320a在肝癌、胰腺癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、甲状腺乳头状癌、黑色素瘤等大部分人肿瘤中频繁高表达。它通过靶向作用于抑癌基因如p27、p57，PTEN，前凋亡因子Bim、Bmf等，抑制细胞凋亡、促进细胞生长和迁移，参与肿瘤的发生发展过程。目前的研究结果提示miRA-320a可能是一种致癌miRNA，在人类多种肿瘤的发生 和发展阶段扮演着至关重要的角色。 

发明内容

本发明的目的是提供检测血液中miR-320a的试剂在制备用于前列腺癌血清学诊断的试剂盒中的应用。 

本发明利用我们发明的异种移植模型和新一代测序技术，对转移和非转移前列腺癌异种移植组织系中miRNAs的转录组学进行了深入的研究，初步发现miR－320a与前列腺癌的恶性程度相关(Watahiki et al.,PLOS One 2011)。 

我们优化了从血清中提取miRNA的方法以及用实时定量PCR检测miRNA的方法；整理和收集了百余份前列腺癌患者的病理资料和血清样本；对用异种移植模型筛选出的在转移前列腺癌组织中上调的19个miRNA序列进行了临床血清样本的检测，揭示了miR－320a在前列腺癌患者血清中和组织中含量明显升高。该发明对开发中国人群前列腺癌的血清学临床诊断方案中具有重要的应用前景。 

本发明首先提供了一种检测血液样品中微小RNAmiR-320a及其前体的试剂在制备用于对对象前列腺癌诊断和治疗方案选择的试剂盒中的应用，所述试剂是对微小RNAmiR-320a及其前体具有特异性的试剂，具体是：对miR-320a及其前体有检测特异性的PCR引物和杂交探针以及利用该探针制备的基因芯片。 

所述miR-320a的序列如SEQ ID NO：1所示； 

在一个优选例中，所述特异性引物选自SEQ ID NO:2所示序列； 

在一个优选例中，所述特异性探针选自SEQ ID NO:5所示序列。 

本发明通过检测血液中miR-320a的含量来诊断对象是否患有前列腺癌。