[发明专利]转基因提高丹参中迷迭香酸含量的方法

权利要求书

1.一种转基因提高丹参中迷迭香酸含量的方法，其特征在于该方法包括下述步骤：

（1）金鱼草Rosea1基因的克隆

提取金鱼草总RNA并反转录成cDNA备用，设计金鱼草Rosea1基因编码框的上游引物、下游引物，并在上游引物上引入BglII限制性酶切位点和保护碱基GAAGATCT，下游引物上引入BstEII限制性酶切位点和保护碱基CAGGGTCACC，上游引物的序列为5’-GAAGATCTATGGAAAAGAATTGTCGTGGAGT-3’，下游引物的序列为5’-CAGGGTCACCTTAATTTCCAATTTGTTGGGCCT-3’，以金鱼草cDNA为模板，经聚合酶链式反应扩增，获得的扩增产物进行电泳分离，回收扩增产物与pMD19-T Simple载体用T4DNA连接酶连接，连接产物采用热激转化法转入大肠杆菌DH5α，连接产物与大肠杆菌DH5α的体积比为1：10，连接产物转入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，随机挑选所得阳性克隆，经菌落聚合酶链式反应检测、测序验证得到所述基因的编码序列如下：

atggaaaaga attgtcgtgg agtgagaaaa ggtacttgga ccaaagaaga    50

agacactctc ttgaggcaat gtatagaaga gtatggtgaa gggaaatggc    100

atcaagttcc acacagagca gggttgaacc ggtgtaggaa gagttgcagg    150

ctgaggtggt tgaattatct gaggccaaat atcaaaagag gtcggttttc    200

gagagatgaa gtggacctaa ttgtgaggct tcataagctg ttgggtaaca    250

aatggtcgct gattgctggt agaattcctg gaaggacagc taatgacgtg    300

aagaactttt ggaatactca tgtggggaag aatttaggcg aggatggaga    350

acgatgccgg aaaaatgtta tgaacacaaa aaccattaag ctgactaata    400

tcgtaagacc ccgagctcgg accttcaccg gattgcacgt tacttggccg    450

agagaagtcg gaaaaaccga tgaattttca aatgtccggt taacaactga    500

tgagattcca gattgtgaga agcaaacgca attttacaat gatgttgcgt    550

cgccacaaga tgaagttgaa gactgcattc agtggtggag taagttgcta    600

gaaacaacgg aggatgggga attaggaaac ctattcgagg aggcccaaca    650

aattggaaat taa                                            663

（2）构建含有金鱼草Rosea1基因的植物表达载体

用BglII和BstEII双酶切含有金鱼草Rosea1基因的pMD 19-T Simple载体和pCAMBIA-1302植物表达载体，回收的酶切产物，用T4DNA连接酶连接，连接产物采用热激转化法转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆，进行菌落聚合酶链式反应检测和提取质粒酶切筛选阳性克隆，得到含有金鱼草Rosea1基因的植物表达载体，该表达载体序列如核苷酸序列表<210>2；

（3）制备含有金鱼草Rosea1基因的植物表达载体的根癌农杆菌菌株

将含有金鱼草Rosea1基因的植物表达载体转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞，采用液氮冻融法进行转化，转化后的产物于28℃恒温培养箱中倒置培养18～36小时，挑取抗性单菌落进行菌落聚合酶链式反应筛选，获得含有金鱼草Rosea1基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；

（4）制备转基因丹参植株

采用常规组织培养方法获得无菌丹参试管苗，根癌农杆菌介导的丹参遗传转化体系采用叶盘法，即将继代培养15天的丹参无菌苗叶片切成小块，转入每1L培养基中含有10mL浓度为1.0mg/mL的6-苄氨基腺嘌呤、1mL浓度为1.0mg/mL的a-萘乙酸的MS培养基上预培养1天，用含有金鱼草Roseal基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株浸染预培养过的丹参叶片，浸染方法为28℃恒温100转/分钟浸染25～30分钟，浸染过的叶片置于每1L培养基中含有10mL浓度为1.0mg/mL的6-苄氨基腺嘌呤、1mL浓度为1.0mg/mL的a-萘乙酸的MS培养基上暗培养2～3天至叶片边缘有农杆菌长出，叶片从培养基上取出，转接到每1L培养基中含有10mL浓度为3mg/mL的潮霉素和10mL浓度为200mg/mL的头孢霉素的MS培养基中进行培养，长出抗性芽后将其转入到每1L培养基中含有10mL浓度为3mg/mL的潮霉素和10mL浓度为200mg/mL的头孢霉素的1/2MS培养基上生根，获得潮霉素抗性的再生丹参植株，用金鱼草Rosea1基因的特异性检测引物聚合酶链式反应扩增再生丹参植株的DNA，波长为302nm的紫外线下观察到663bp目的条带的阳性株系即为转基因丹参植株。

2.根据权利要求1所述的转基因提高丹参中迷迭香酸含量的方法，其特征在于在构建含有金鱼草Rosea1基因的植物表达载体步骤（2）中，所述的用BglII和BstEII双酶切为：取含有金鱼草Rosea1基因的pMD19-T Simple载体、10×H Buffer、二次蒸馏水、限制性内切酶BglII于37℃反应1小时20分钟，再加入限制性内切酶BstEII，60℃反应1小时，限制性内切酶BglII与限制性内切酶BstEII、含有金鱼草Rosea1基因的pMD19-TSimple载体、二次蒸馏水、10×HBuffer的体积比为3：3：20：19：5；

取pCAMBIA-1302植物表达载体、10×H Buffer、二次蒸馏水、限制性内切酶BglII于37℃反应1小时20分钟，再加入限制性内切酶BstEII，60℃反应1小时，限制性内切酶BglII与限制性内切酶BstEII、pCAMBIA-1302植物表达载体、二次蒸馏水、10×H Buffer的体积比为3：3：20：19：5。