[发明专利]使用简并引物检测海水中细菌过氧化氢酶多样性的方法

说明书

技术领域

本发明属于海洋微生物生态学领域，特别是涉及使用简并引物检测海水中细菌过氧化氢酶多样性的方法。

背景技术

生命活动中，特别是有氧代谢过程中会产生过氧化氢。过氧化氢是一种活性氧，氧化性强，危害性大。过氧化氢酶能迅速分解过氧化氢，保护生物分子免受氧化损伤；过氧化氢酶是嗜氧微生物生命活动中一直保持活性的重要持家蛋白。

海洋中广泛存在低温环境，低温条件下氧气溶解度增大，氧浓度提高使低温微生物更容易受到活性氧的影响。过氧化氢酶是嗜氧低温生物代谢必需的抗氧化酶。完成基因组测序的海洋低温细菌都有过氧化氢酶基因，如Desulfotalea psychrophila，Colwellia psychrerythraea和Pseudoalteromonas haloplanktis等。过氧化氢酶研究对于认识海洋微生物在低温下有氧代谢活动规律有重要意义。

海水表层过氧化氢含量受到太阳紫外线辐射和降水的影响，某些地区表层海水中过氧化氢浓度可达1.45μmol/L。生活在含高过氧化氢的表层海水中的细菌面临氧化胁迫，推测这些细菌只有具备较高活性的过氧化氢酶才能维持代谢活动正常进行。表层海水中的微生物过氧化氢酶分解紫外辐射产生的过氧化氢，这一过程放热促进海冰融化，具有重要的生态影响。

为了深入认识海洋微生物过氧化氢酶的生态作用，有必要建立研究微生物过氧化氢酶多样性的方法。目前可以直接检测海水中过氧化氢酶活性，但直接测活的方法无法研究过氧化氢酶的种类和含量，因此无法获得多样性的信息；构建宏基因组文库并测序，可以获得环境中过氧化氢酶基因的信息，但价格昂贵耗时太长，因此无相关报道；使用特异的保守引物扩增环境样品DNA中的目的基因，是研究环境基因多样性的理想方法。目前尚无用于扩增环境中过氧化氢酶基因的保守引物，因此也没有发展出相应的过氧化氢酶多样性检测方法。

发明内容

本发明目的在于克服上述现有技术中存在不足，经发明人长期从事海洋微生物领域的开发研究和生产实践，从而开发提供一种精确、可靠、快速的使用简并引物检测海水中细菌过氧化氢酶多样性的方法,

本发明提供的使用简并引物检测海水中细菌过氧化氢酶多样性的方法,包括下述步骤：

1）、从GenBank搜集各类已知的细菌过氧化氢酶蛋白序列，进行多序列比对后，找出保守的氨基酸序列，由此获得合适的四种简并引物,四种简并引物均根据过氧化氢酶蛋白序列的保守区设计，四种简并引物序列包括两种正向简并引物序列(5’至3’)为：

C3+:TTTYAAYCGAGARMGRGTNCCNGARMGNG；

CA:GTACCTGAAMGRGTRGTSCAYGCNMRRGG；

和两种反向简并引物序列(5’至3’)为：

CB:GAATATGCAAAAAGGCGNCCYTGNARNAKYTTRTC；

C3-:AATCTTTATGAGGCCAAACTTTTGTNANRTCR;

2)使用步骤1)中四种简并引物任一组合，以聚合酶链式反应（以下简称PCR）扩增过氧化氢酶基因片段,PCR扩增使用12.5微升反应体系：所述反应体系为2.5mM脱氧核糖核苷三磷酸（以下简称dNTP）1微升，10×水生栖热菌（Taq）DNA聚合酶（以下简称Taq酶）PCR缓冲液1.25微升，50μM的两种简并引物各0.1至0.2微升，Taq DNA聚合酶0.5至0.7U，海水DNA 1微升，加水至总体积12.5微升;制备过氧化氢酶基因片段时每次使用4至8个12.5微升PCR扩增体系;PCR扩增条件：94℃1至2分;94℃20至40秒,60℃→51℃50至80秒,72℃1分30秒,10至15个循环，每循环降低退火温度1℃；94℃20至40秒,50℃50至80秒,72℃1分,20循环；72℃3分。反应后合并各管PCR扩增产物，纯化分子量在500bp至1000bP的单一PCR扩增产物;;

3)使用T载体试剂盒（宝生物公司产品）连接步骤2)的PCR扩增产物，转化大肠杆菌感受态细胞构建过氧化氢酶的基因片段的T载体文库,蓝白斑筛选;挑取所有菌落扩增，使用相应的过氧化氢酶简并引物进行菌落PCR扩增寻找阳性克隆;琼脂糖凝胶电泳确认目标PCR扩增产物即过氧化氢酶基因片段;

4)向步骤3)的所有目的PCR扩增产物中加入限制性核酸内切酶MboI及其缓冲液，酶切后使用琼脂糖凝胶电泳检测所有酶切反应液中的核酸片段，每一种特异的不重复的电泳条带类型对应着一种过氧化氢酶基因。确定过氧化氢酶基因的种类数以及每种基因的数目;