[发明专利]一种含乳酸菌的复合益生菌饲料添加剂及其制备方法

权利要求书

1.一种含乳酸菌的复合益生菌饲料添加剂，其特征在于：是由40-60％的嗜酸乳酸杆菌、15-20％的嗜淀粉乳酸杆菌、5-10％唾液乳酸杆菌、5-10％嗜热链球菌、5-10％多形拟杆菌和5-10％的葡萄糖经喷雾冷冻干燥复合形成。

2.根据权利要求1所述的含乳酸菌的复合益生菌饲料添加剂，其特征在于：所有菌株均分离自猪肠道食糜。

3.一种含乳酸菌的复合益生菌饲料添加剂的制备方法：其特征在于，包括以下步骤：

A、动物肠道中嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌、嗜热链球菌和多形拟杆菌的分离、纯化与鉴定：

A1、样本的采集与稀释：

无菌取猪空肠和盲肠内容物各1g，分别置于含有小玻璃珠的灭菌三角瓶内(50mL)，按1∶10(g∶V)的比例加入灭菌生理盐水，充分振荡30分钟，使其成为均匀的悬液，此悬液为第一个稀释度(10-1)，另取灭菌小试管若干，每支加入灭菌生理盐水4.5mL，取10-1稀释液0.5mL加入第二管混匀得第二稀释度(10-2)，依次类推作递减稀释，终稀释度为10-11；

A2、配制选择性培养基：

嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌和唾液乳酸杆菌的选择性培养基制备方法如下：酪朊水解物10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、柠檬酸二铵2g、吐温801.0mL、三水醋酸钠25g、磷酸二氢钾6g、七水硫酸镁0.58g、七水硫酸亚铁0.03g、四水硫酸猛0.15g、琼脂15g，调节pH至5.4，于121℃灭菌15min，倾注灭菌平皿，-4℃保存备用；

嗜热链球菌的选择性培养基制备方法如下：胰蛋白胨10g、大豆蛋白胨5g、牛肉浸膏5g、酵母浸膏5g、葡萄糖20g、氯化钠5g、L-半胱氨酸盐酸盐0.3g、琼脂15g、蒸馏水1L、试剂A、试剂B，将以上成分加热溶于1L蒸馏水中，调节pH至6.1，于121℃灭菌15min，冷却至约50℃，加入试剂A和试剂B，前者100mL，后者10mL，混匀后倾注灭菌平皿，-4℃保存备用；

多形拟杆菌的分离选用NBGT血琼脂培养基其制备方法如下：马肉浸液930mL、脙蛋白胨10g、酵母浸膏5g、葡萄糖1.5g、L-胱氨酸0.2g、L-半胱氨酸0.5g、牛磺胆酸钠1g、琼脂15g，将各固体成分加热溶化于马肉浸液中，调pH至7.8，于121℃灭菌15min。冷却至约50℃，每95mL，以无菌操作加入新霉素(2mg/mL水溶液)0.2mL，0.1％煌绿水溶液0.1mL和脱纤维马血5mL，混匀后倾注灭菌平皿，于-4℃下保存备用；

A3、接种：

选择10-5、10-6和10-7三个稀释度进行接种，每个稀释度接种三个平皿，每个平皿接种100uL悬浊液，接种后用涂布器涂布均匀。

培养结束后于平皿中选择疑似菌落在相应的培养基上进行划线培养，以达到纯化菌种的目的，培养条件同上；

A4、鉴定：

提取纯化后各菌株的DNA和16S rRNA进行碱基序列分析，并用BLAST软件包中的Clustal W程序与GeneBank中的碱基序列进行对比，DNA序列相似度大于70％且16S rRNA序列相似度大于90％时判定为该菌株；

B、扩大培养

B1、一次扩培：

一次扩培培养基制备方法如下：嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌和嗜热链球菌的扩培培养基配方如下：大豆蛋白胨50

g、牛肉浸膏50g、酵母浸膏50g、葡萄糖200g、乳糖20g、鲜柑桔汁50mL，将以上组份溶解于1L去离子水中，于121℃条件下灭菌20min，冷却后-4℃保存备用；

多形拟杆菌扩培培养基配方如下：酪蛋白胨10g、大豆蛋白胨3g、脙蛋白胨10g、酵母浸膏5g、牛肉浸膏2.2g、葡萄糖3g、磷酸二氢钠2.5g、血清消化蛋白胨或消化血液13.5g、氯化钠3g、可溶性淀粉5g、L-半胱氨酸0.3g、硫乙醇酸纳0.3g，将以上组份溶解于1L去离子水中，调节pH至7.3，于121℃条件下灭菌15min，冷却后-4℃保存备用；

将一次扩培培养基分装于100mL培养瓶中，每瓶分装20mL，用接种丝挑取经鉴定后的嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌和嗜热链球菌菌落，分别接种到培养基中，在36℃下，一个大气压的90％氮气+10％二氧化碳环境中厌氧静置培养16-18h，待pH为3.8-4.5时，一次扩培完成。多形拟杆菌于37℃条件下，厌氧静置培养76h；

B2、二次扩培：二次扩培培养基制备方法如下：

嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌和嗜热链球菌的扩培培养基配方如下：大豆蛋白胨200g、棉籽糖20g、鲜柑桔汁100mL、氯化钠10g，将以上组份溶解于2L蒸馏水中，放置到容量为4L的小型发酵罐中，于121℃条件下灭菌20min备用；

多形拟杆菌二次扩培培养基配方如下：胰化酪蛋白胨150g、大豆蛋白胨50g、磷酸氢二钾25g、氯化钠50g、可溶性淀粉5g、L-半胱氨酸0.3g、硫乙醇酸纳0.3g，将以上组份溶解于1L去离子水中，调节pH至7.3，放置于2L的小型发酵罐中，于121℃条件下灭菌15min备用；

将各个菌株的一次扩培发酵液同时接种到二次扩培培养基中，乳酸菌在40℃温度下恒温厌氧静置培养12-14h，pH达3.8-4.5时完成二次扩培；多形拟杆菌在37℃下恒温厌氧静置培养48h后完成二次扩培；

B3、收集发酵菌泥：

将二次扩培得到的发酵液无菌操作装入离心管中，25℃条件下，10000rpm/min离心5min，弃去上清液，所得离心沉淀物即为菌泥，用1％蛋白胨水溶液将菌泥重新悬浮成为悬浊液，且使细菌浓度约为109cfu/mL；

B4、喷雾急速冷凝法对各菌株进行微胶囊包被处理

B41、海藻酸盐混合物的制备：将海藻酸钠2％(w/v)、MRS肉汤5.5％(w/v)，甘油5％(w/v)、黄源胶0.26％(w/v)、吐温200.1％(w/v)和细菌悬浊液20％(w/v)加入一定量的蒸馏水中混匀即得；

B42、将以上混合物注入雾化器中雾化，雾化时空气压力为0.6kgf/cm2，液体压力为0.4kgf/cm2；

B43、雾化后的液体微滴用装有适量氯化钙溶液(0.5mol/L)的收集槽中，收集过程中通过磁力搅拌器不轻轻搅拌氯化钙溶液；

B44、液体微滴在氯化钙溶液中硬化15min，然后用高密筛网过滤，并用蒸馏水洗涤两次，然后再转入壳聚糖乳酸溶液中，轻轻搅拌15min使海藻酸盐微胶囊表面被均匀包被；

B45、再将B44处理后的微胶囊过滤并洗涤后，于-72℃冷冻干燥6h，然后于-75℃再干燥18h，干燥时压力设定为5.33Pa。