[发明专利]负载溶菌酶的壳聚糖/γ-聚谷氨酸复合纳米粒子的制备方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种长效安全的抗菌纳米材料的制备方法，具体涉及一种负载溶菌酶的壳聚糖/γ-聚谷氨酸复合纳米粒子的制备方法，属于医药工程技术领域。 

（二）背景技术

溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种能水解致病菌中粘多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂，内容物溢出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，溶菌酶具有抗菌、消炎和抗病毒的作用，并且不产生耐药性，所以溶菌酶在一定程度上可以代替抗生素，具有较大的应用潜力。 

口服给药要受到两种首过效应的影响，即胃肠道上皮细胞中酶系的降解、代谢及肝中各酶系的生物代谢。许多药物很大一部分因首过效应而代谢失效，如肽类和蛋白类药物等。为获得良好的治疗效果，通常不得不将口服给药改为注射等其它给药途径。由于通过注射途径的非靶向药物均匀分布在全身循环中，到达病灶之前，要经过同蛋白结合、排泄、代谢、分解等步骤，所以最终只有少量药物能达到病灶。靶向给药的目的就是提高靶区的药物浓度，从而提高药物的利用率、疗效以及降低药物的副作用，这一直是医药领域一项重要的研究课题。纳米药物载体的研究能有效地解决这些问题。 

高聚物纳米材料作为药物载体已经获得广泛研究。其中合成的可生物降解高分子材料，如聚己内酯和聚乳酸等，由于其良好的生物相容性颇受关注。然而用聚己内酯和聚乳酸制备的纳米材料由于其疏水性，对于亲水性药物的输送效果不显著。因此，对于亲水性药物容菌酶的包埋，可以选择壳聚糖和γ-聚谷氨酸(γ-PGA)作为载体材料，通过壳聚糖和γ-聚谷氨酸之 间发生离子交联，制备纳米载体。这种纳米载体的优点是不使用有毒溶剂，制备条件较缓和。这可以避免有机溶剂的存在导致溶解酶不稳定，因为有机溶剂会使蛋白或肽类物质发生降解。 

壳聚糖由于其独特的性质倍受人们关注。其中，壳聚糖来源丰富，并且有很好的抗菌性，是其备受关注的焦点。壳聚糖是甲壳素脱乙酰化的产物，通常脱乙酰度达到50%-95%之间就可以成为很好的壳聚糖。壳聚糖基本结构单元为壳二糖，壳聚糖是D-氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键结合而成的多糖，化学名为聚（2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖），是自然界中唯一存在的带正电的天然多糖，它无毒副作用，具有良好的生物相容性、生物可降解性、吸湿性和保湿性，有明显的抗菌抑菌作用，具有表面多孔结构，是良好的药物缓释剂和保水剂，其形成和结构式可表示为： 

γ-PGA是由D-谷氨酸或L-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基形成γ-酰胺键连接而成。γ-PGA分子链上具有大量活性较高的游离侧链羧基，易于修饰和与药物的结合，形成稳定的复合物，可提供药物缓释性和靶向性，降低药物不良反应，从而提高药物疗效。此外γ-PGA具有良好的生物亲和性和生物降解性，不易产生蓄积和毒副作用。 

目前，壳聚糖与γ-聚谷氨酸通过离子交联法制备纳米粒子的研究并不很多，到目前为止，并没有获得既能够大大降低药物突释率，又能够获得程序性梯度药物释放的药物包埋纳米体系。 

（三）发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种负载溶菌酶的壳聚糖/γ-聚谷氨酸复合纳米粒子的制备方法，制得的负载溶菌酶的壳聚糖/γ-聚谷氨酸复合纳米粒子能减少溶菌酶的初期突释，有效延长药物的释放时间，并达到程序性梯度释放。 

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案： 

一种负载溶菌酶的壳聚糖/γ-聚谷氨酸复合纳米粒子的制备方法，所述制备方法是以质量比为20：5~16：1~5：1~8的壳聚糖、γ-聚谷氨酸、三聚磷酸钠和溶菌酶为原料，首先是通过γ-聚谷氨酸与溶菌酶之间的离子交联作用制备成γ-聚谷氨酸/溶菌酶复合纳米粒子，再利用壳聚糖与γ-聚谷氨酸之间存在离子交联作用，并借助少量三聚磷酸钠作为辅助离子交联剂对制得的γ-聚谷氨酸/溶菌酶复合纳米粒子进行再包裹，得到负载溶菌酶的壳聚糖/γ-聚谷氨酸复合纳米粒子，具体包括如下步骤： 

（1）将0.5~5.0mg/mL的γ-聚谷氨酸水溶液与0.5~5.0mg/mL的溶菌酶水溶液混合，不断搅拌至有蓝色荧光出现并稳定存在，即得到γ-聚谷氨酸/溶菌酶复合纳米粒子溶液；