[发明专利]他克莫司粗品的纯化方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种医药生物技术领域的纯化方法，尤其涉及一种他克莫司粗品的纯化方法。

【背景技术】

他克莫司是一种新型强效的大环内酯类免疫抑制剂，最早由日本藤泽药品工业公司探索研究所于1984年自日本筑波山土壤中分离到的筑波霉菌的发酵液中提取得到；1989年他克莫司首次应用于临床肝脏移植；1991年日本开发的名为普乐可复（Prograf）他克莫司胶囊剂和注射剂正式上市，用于原发性肝移植和肾移植的排斥反应治疗，后又被批准用于骨髓移植。目前他克莫司制剂已在日本、美国、英国、德国、加拿大、丹麦、法国、意大利、西班牙、爱尔兰等80多个国家上市，广泛应用于肝脏、胰腺、肾脏、心脏和肺等实体器官移植后的抗排异治疗。1999年他克莫司软膏投放日本市场，用于治疗成人的特应性皮炎。此外，他克莫司对牛皮癣、银屑病、鱼鳞病、糖尿病、白塞氏病、变应性皮炎、类风湿性关节炎以及多发性硬化病等自身免疫病有疗效。

主要地，由于他克莫司来源于发酵产品，发酵过程同时也产生了多个他克莫司类似物，包括二氢他克莫司和子囊霉素等杂质；这些杂质和他克莫司结构极为相似，物理化学性质相近，通过常规的纯化技术难于获得较高纯度的原料药，从而难以满足市场需要。现有关于他克莫司分离纯化的文献中虽然均揭露了用吸附树脂或改性硅胶来精制他克莫司，但存在着纯化收率低、工业化成本高的问题。

次要地，高速逆流色谱技术（high-speed counter-current chromatography，HSCCC）是基于流体动力学原理开发的一种新兴无固体载体的高效液-液分配色谱技术，已成功应用于多种天然中药和活性成分分离，并开始在微生物发酵药物分离过程中应用。随着高速逆流色谱技术的发展，制备型逆流色谱仪已开始得到应用，但如何节约溶剂并进行连续生产并未见相关报道。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题在于提供一种他克莫司粗品的纯化方法，不仅能够获得高纯度的他克莫司，且具有较高的纯化收率，从而可降低工业化的成本。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种他克莫司粗品的纯化方法，该纯化方法包含如下具体步骤：

（1）用第一混合有机溶剂溶解他克莫司粗品以获得浓度为5-40g/L他克莫司粗品溶液，之后将该他克莫司粗品溶液进行超声振荡，超声频率40KHz，超声时间30-60min；所述第一混合有机溶剂由甲基叔丁基醚、甲醇和水按100～110:340～380:275～305的体积比混合而成；

（2）将步骤（1）超声结束后的他克莫司粗品溶液进行快速滤纸抽滤，抽滤所得的滤液即样品溶液采用制备型高速逆流色谱仪进行连续纯化并收集含他克莫司的主峰；

（3）合并步骤（2）收集所得的收集液，之后依次进行减压浓缩、有机溶剂萃取、浓缩萃取液并重结晶以获得产品；

进一步地，所述步骤（2）中制备型高速逆流色谱仪的色谱条件为：

制备型高速逆流色谱仪：上海同田生物技术有限公司生产的TBE-5000A型制备型高速逆流色谱仪；

溶剂体系：单独配置流动相与固定相；其中流动相为所述第一混合有机溶剂；固定相为第二混合有机溶剂，且该第二混合有机溶剂由体积比为13～16:11～13.5:0.9～1.1的正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇组成；

进样方式：连续进样；

主机转速：450-500rpm；

流动相流速：20-25ml/min；

检测波长：254nm；

制备温度：20-25℃；

在线检测软件：N2000色谱工作站。

进一步地，所述步骤（2）中采用制备型高速逆流色谱仪纯化的过程为：将所述固定相以75-100ml/min的流速装满色谱分离柱，然后开启速度控制器使逆流色谱仪按顺时针方向旋转，当主机转速达到450-500rpm时，以20-25ml/min流速泵进该流动相，待流动相流出且两相溶剂体系在色谱柱内达到平衡时，取所述样品溶液进样200ml，然后分段收集含他克莫司的主峰。

进一步地，所述第二混合有机溶剂的制备过程为：将正己烷、甲基叔丁基醚和甲醇按体积比13～16:11～13.5:0.9～1.1混合搅拌20-30min，之后采用40KHz频率的超声波脱气20-30min即可。

进一步地，所述步骤（3）中的有机溶剂为乙酸乙酯或乙酸丁酯。