[发明专利]基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构的DNA测序装置及方法

说明书

技术领域

本发明属于DNA分子测序技术领域，具体涉及一种基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构的DNA测序装置及方法。

背景技术

脱氧核糖核酸（DNA）测序技术是现代生命科学研究的核心技术之一。为实现千美元人类基因组(TDG)、百美元人类基因组(HDG)目标，推进个体化疾病诊断与治疗，迫切需要一种低成本、高通量的直接测序方法。基于纳米孔的单分子测序被认为是最有希望实现上述目标的关键技术。

截止目前，已经报道的各种基于纳米孔的DNA单分子测序方法中，离子电流阻塞法提出的最早，研究也最为广泛。这种方法的基本原理如下，测序反应腔被带有纳米孔的膜一分为二，单链DNA分子被加入到膜的一边，在膜另一边正电位电极的吸引下，带有负电荷的聚合链进入纳米孔，并从膜的一边滑动到膜的另一边,在聚合链穿越纳米孔时对会对原有的纳米孔中离子电流造成堵塞，电流会急剧下降到原电流的10％左右，研究人员通过对多聚核苷酸链穿越过程的穿越时间(t)、阻塞发生的间隙(Δt)以及阻塞电流(IB)的定量检测来实现DNA分子测序。

然而，这种纳米孔离子电流阻塞法在实际应用中面临一些根本性的问题。早期所采用的生物分子纳米孔（其典型代表是α-溶血素蛋白分子（proteinα-hemolysin）构成的纳米孔）稳定性差、寿命短，对环境因素极其敏感,且生物分子纳米孔的孔径难以人工控制，内部孔径仅约为1.5nm，不适于不同核酸分子的检测。目前普遍采用的固态纳米孔(Solid-state nanopore)虽然克服了上述生物分子纳米孔的缺点，但是也存在如下问题：首先，固态纳米孔通道长度通常为5nm以上,可以容纳十多个碱基,这一尺寸对于测序所需要的分辨单个碱基引起的电流变化过长；其次，当单个核苷酸占据纳米孔时只有大约100个离子穿过纳米孔，而4个碱基在结构上只有数个原子的差异，这种细微的结构化差异导致的离子电流变化很微弱，以至于研究人员很难区分出每个碱基；第三，基于固态纳米孔的测序方法目前尚不能有效地控制DNA通过纳米孔的速度，由于速度太快，造成了碱基检测识别率不高。这些问题严重制约了这种测序方法的实际应用。

借助于其他辅助手段的各种纳米孔测序方法，如荧光标记辅助纳米孔测序法、杂交辅助纳米孔测序法、隧道电流辅助纳米孔测序法、以及探针修饰纳米孔测序法等，在本质上仍属于间接测序方法，存在设备复杂、低速、高成本等问题。所以，实现千美元人类基因组(TDG)目标、甚至百美元人类基因组(HDG)目标，推进个体化疾病诊断与治疗的发展，需要新型的直接、高效、低成本测序方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出了一种基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构的DNA测序装置及方法，能够实现DNA分子的准确、高效、低成本测序。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

基于石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构的DNA测序装置，该DNA测序装置是以石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构为核心组装的测序装置，具体包括置于电解液11中的硅基衬底1，在硅基衬底1上半部刻蚀有倒金字塔形微腔2，下半部刻蚀有直径大于倒金字塔形微腔2塔底直径的柱状孔，倒金字塔形微腔2的塔顶为固态纳米孔3，绝缘层6包覆在硅基衬底1外部，在硅基衬底1上部有通过内置电极8固定于绝缘层6上的石墨烯微带4，石墨烯微带4上刻蚀有石墨烯纳米孔5，石墨烯纳米孔5和固态纳米孔3同轴，所述石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构将测序反应腔分为上下两部分，置于反应腔上部的外接电极7接负电位，置于反应腔下部的外接电极7接正电位，外接电极7和纵向微弱电流测量设备9以及电源12构成纵向微弱电流测量回路，内置电极8和横向微弱电流测量设备10以及电源14构成横向微弱电流测量回路。

所述固态纳米孔3的直径为1.5-10nm。

所述石墨烯纳米孔5的直径为1.5-7nm。

所述石墨烯微带4为单层或多层石墨烯。

所述纵向微弱电流测量设备9为皮安级电流测量仪。

所述横向微弱电流测量设备10为亚微安级电流测量仪。

用于产生驱动单链DNA分子13穿越石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构的静电场由电源12提供，所述电源12的偏置电压应为0.05-0.2V，靠近石墨烯纳米孔-微腔-固态纳米孔结构中石墨烯纳米孔5一侧的电极接负电位，靠近固态纳米孔3一侧的电极接正电位。

所述电解液11为KCl、NaCl或LiCl溶液，其浓度为0.8～1.5mol/L,pH值为8.0。