[发明专利]环脂肽类抗生素及其制备和应用

权利要求书

1.一种环脂肽类抗生素，其特征是：结构简式如下：

其中L-Dab为L型2,4-二氨基丁酸，L-Ile为L型异亮氨酸，D-Phe为D型苯丙氨酸，L-Leu为L型亮氨酸，D-Val为D型缬氨酸，L-Thr为L型苏氨酸。

2.一株制备环脂肽类抗生素的菌株，其特征是：所述菌株为类芽孢杆菌（Paenibacillus ehirnensis strain B7），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2012年6月24日，地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M 2012244。

3.环脂肽类抗生素的制备方法，其特征是步骤为：

（1）培养发酵：将类芽孢杆菌（Paenibacillus ehirnensis strain B7）接种到发酵培养基，得到活化菌株，活化菌株在种子培养基中振荡培养两次，得到二级种子液，二级种子液接入发酵培养基中振荡培养发酵，得到发酵液，离心、取发酵液上清，去沉淀，先经大孔吸附树脂吸附，将发酵上清以合适速度流经用蒸馏水平衡好的、装填有大孔吸附树脂的层析柱；

（2）分离纯化：待样品上完后，先分别用蒸馏水和甲醇水溶液冲洗，然后用甲醇水溶液洗脱；收集各洗脱峰，测活，将活性组分浓缩蒸干得到粗品；将粗品用甲醇溶解，离心过滤，用固相萃取柱进一步纯化；再用制备型高效液相色谱进行精纯，收集活性组分，浓缩、冻干即可得到所述环九肽菌素。

4.如权利要求3所述环脂肽类抗生素的制备方法，其特征是具体步骤为：

（1）将保存于-80℃冰箱的甘油管中的类芽孢杆菌（Paenibacillus ehirnensis strain B7）转接到营养琼脂培养基上，28～35℃培养24～96h，得到活化菌株；

营养琼脂培养基，按如下组成配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，pH7.2；

（2）将活化菌株接入盛于250mL三角瓶的50mL种子培养基中，于28～35℃，220rpm振荡培养24h，即为一级种子液；

（3）将步骤（2）所得的一级种子液接入盛于500mL三角瓶的200mL种子培养基中，于28～35℃，220rpm振荡培养24h，即为二级种子液；

种子培养基为营养肉汤培养基，按如下组成配制：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，自来水1000mL，pH7.2；

（4）将步骤（3）所得的二级种子液按体积比5%～10%的接种量接入含500mL发酵培养基的2L三角瓶中，于28～35℃，200rpm振荡培养96h，获得发酵液；

发酵培养基按如下组成配制：葡萄糖，0～10g/L；CaCl₂，0.01～0.7g/L；MgSO₄·7H₂O，0.05～1g/L；ZnSO₄，0.005～0.1g/L；NaCl，0.05～0.5g/L；FeSO₄，0.005～0.05g/L；(NH₄)₂SO₄，0.5～4.0g/L；MnSO₄·H₂O，0.001～0.01g/L；KH₂PO₄， 0.5～5g/L；溶剂为蒸馏水，pH 7.0～7.5；

（5）步骤（4）取得的发酵液转到离心瓶中，平衡后于6500×g离心30min，去除沉淀，得澄清发酵上清液；

（6）将步骤（5）所得的上清液以10～50mL/min的流速流穿用蒸馏水平衡好的Amberlite XAD-16层析柱，待样品上完后分别用蒸馏水及含体积比为45%的甲醇的水溶液各冲洗5个床体积，然后用含体积比为90%的甲醇的水溶液洗脱，收集体积比为90%的甲醇水溶液洗脱的洗脱峰，55～65℃浓缩蒸干，得到粗品1；

（7）将粗品1用甲醇溶解，用0.45μm的滤膜过滤后上样至用体积比25%的乙腈水溶液平衡好的C-18固相萃取柱，样品加完后再用体积比为25%的乙腈水溶液冲洗5个床体积，然后用体积比65%的乙腈水溶液洗脱，收集洗脱峰，浓缩蒸干，得到粗品2；

（8）将粗品2用甲醇溶解、12000rpm离心10min，并过0.45μM滤膜后，用制备型HPLC进行分离；分离后A液为含体积比0.1%三氟乙酸的水溶液，B液为色谱纯乙腈；洗脱梯度为：在40min时间里B液从体积比15%提高到60%；收集活性部分，55～65℃浓缩、-50℃～-60℃真空冷冻干燥，即得产品环脂肽类抗生素。