[发明专利]一种MTHFRD基因多态性C677T的检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于体外核酸检测领域，涉及采用基于荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer,FRET)的实时荧光PCR技术检测MTHFR基因多态性(C677T)的方法及试剂盒。

背景技术

叶酸是由喋呤啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸等组成的化合物，是一种水溶性B族维生素。叶酸对人体的重要营养作用早在1948年即已得到证实。叶酸是人体在利用糖分和氨基酸时的必要物质，是机体细胞生长和繁殖所必需的物质。叶酸在制造核酸（核糖核酸、脱氧核糖核酸）上扮演重要的角色。叶酸帮助蛋白质的代谢，并与维生素B12共同促进红细胞的生成和成熟，是制造红血球不可缺少的物质。叶酸对细胞的分裂生长及核酸、氨基酸、蛋白质的合成起着重要的作用。人类（或其他动物）如缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症，还会导致身体无力、易怒、没胃口以及精神病症状。此外，研究还发现，叶酸对孕妇尤其重要。如在怀孕头3个月内缺乏叶酸，可导致胎儿神经管发育缺陷，从而增加裂脑儿，无脑儿的发生率。其次，孕妇经常补充叶酸，可防止新生儿体重过轻、早产以及婴儿腭裂（兔唇）等先天性畸形。但是适应物极必反的原则，叶酸也不能滥补，长期服用叶酸会干扰孕妈妈的锌代谢，锌一旦摄入不足，就会影响胎儿的发育。

人类基因组DNA中5,10亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸代谢系统中的关键酶，能催化5，10亚甲基四氢叶酸转变为5-甲基四氢叶酸，而后者为同型半胱氨酸转化为蛋氨酸的甲基供体。MTHFR基因677位单核苷酸多态性(C677T)导致第222位丙氨酸被缬氨酸替代，影响酶的催化结构域，形成热不稳定的蛋白质，酶活性降低约70%。从而引起叶酸代谢障碍，引发多种疾病，其中以高同型半胱氨酸血症引起的脑卒中以及新生儿缺陷最为严重。检测MTHFR基因型，可以提示脑卒中风险性，同时还能指导孕妇服用叶酸，降低唐氏综合征、唇腭裂、神经管缺陷等新生儿缺陷。在中国人中，高达17%-47%的人为MTHFR基因异常人群。

MTHFR基因正常的人，摄入的叶酸能够在体内顺利代谢，降低高同型半胱氨酸的水平。这类人脑中风、冠心病和静脉血栓的发病风险较低。MTHFR基因异常的人，摄入的叶酸在体内的代谢途径受阻，可能引起高同型半胱氨酸血症，导致凝血倾向增高，因此发生脑中风、冠心病以及静脉血栓的风险也增高。

我国推荐孕期补充量为400微克/天，对于：MTHFR基因正常的人，摄取推荐量的叶酸，能够显著降低患儿的出生缺陷率。MTHFR基因异常的人，MTHFR酶活性明显降低，对叶酸代谢造成障碍，导致新生儿神经管缺陷、唐氏综合症及唇腭裂等疾病的发病风险明显增高。对于这类人需要补充更多的叶酸才能达到预期的效果。所以对MTHFR基因的检测在临床意义上具有重大的作用。

目前MTHFR基因多态性(C677T)检测方法有以下几种：首先是作为“金标准”的基因测序，具有较高的特异性，并且能够大通量地检测，但是因为测序仪器很昂贵，没有办法普及，如果通过第三方服务来进行检测，则需要较高的时间成本，标本的保存与运输也是一种挑战。基于分子水平，迄今国内外报道对MTHFR基因的检测方法大都是采用PCR-RFLP，此方法以来限制性内切酶消化，电泳分析，酶切不完全往往被误判为杂合子，因为PCR产物要进行开管操作，容易形成气溶胶，导致假阳性的产生。电泳分析需要制备聚丙烯酰胺凝胶，EB染色，费时费力，并且有化学性危害。日前有采用MGB探针的方法，此方法能够避免开盖污染，具有较强的特异性，但是MGB探针的合成要求较高，国内只有数家公司可以合成，并且价格昂贵不适合常规的检查。

发明内容

本发明的目的即在于克服背景技术的以上缺陷，提供一种PCR-FRET法的检测试剂盒，以对MTHFR基因多态性(C677T)进行检测。

本发明的技术方案如下：

一种MTHFRD基因多态性C677T的检测试剂盒，包括如下的引物对：

MTHFR-F：5’-TCATCCCTCGCCTTGAACAG-3’

MTHFR-R：5’-CTCAGCGAACTCAGCACTCC-3’