[发明专利]利用LAMP检测溶藻弧菌的引物组及其快速诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种利用LAMP检测溶藻弧菌的引物组及其快速诊断试剂盒。

背景技术

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是一种嗜盐性革兰氏阴性细菌，广泛分布于河口和海洋环境中，是引起鱼、虾、贝等多种海水养殖动物致病和死亡的主要致病性弧菌，可引起伤口感染、胃肠炎和败血症等症状，严重威胁着水产养殖业发展，造成的经济损失巨大。近年来，由于溶藻弧菌引起食物中毒事件的不断出现，使人们进一步认识到了溶藻弧菌对人类的致病性和危害，也因此将其列入食源性致病菌的范畴，成为食品卫生日常监测和检疫对象。  

目前，我国针对水产养殖中溶藻弧菌等细菌性致病菌的预防缺乏有效的措施，主要依赖于抗生素的广泛使用，导致了耐药菌株的出现，同时也对人类的健康构成威胁。此外，检测手段滞后，仍以传统的分离培养、生物化学反应鉴定为主，虽然检测结果准确，但是实验操作较繁琐、费时费力，一般需要5-7d完成检测，影响检测时限。因此，发展操作简便、快速准确、灵敏度高且易推广的检测方法，对溶藻弧菌进行早诊断和早预防，提高食品卫生水平，保证食品安全具有重要意义。

LAMP技术是具有巨大发展潜力的一种高新检测技术，具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强、检测成本低廉等优点，已在疾病诊断、物种鉴定等领域得到广泛应用。该方法的技术特点是依赖于能够特异性识别靶基因上6个特定区域的4条引物，利用具有链置换活性的DNA聚合酶，60-65℃恒温条件下，40-60min内即可完成检测工作，伴随目标DNA的不断扩增，产生大量的LAMP副产物-焦磷酸镁白色沉淀，使反应溶液变浑浊，并以此作为直接的结果判断依据。

溶藻弧菌主要有6个毒力相关基因，即铁调蛋白基因（fur）、鞭毛蛋白基因（flaA）、胶原酶基因（valC）、碱性丝氨酸蛋白酶基因（aspA）、外膜蛋白基因（ompK和OmpW）。根据靶基因种内高度保守、种间高度特异的选择原则，经过序列BLAST比对分析，溶藻弧菌的胶原酶基因是作为检测靶基因的理想候选者。本发明选取了溶藻弧菌胶原酶基因作为靶基因，根据其保守区设定合成了4条LAMP反应专用引物，建立了溶藻弧菌的LAMP检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有快速、准确、灵敏度高、特异性强、检测成本低的一种检测溶藻弧菌的LAMP引物组及其快速诊断试剂盒。本发明利用Genbank中已发布的溶藻弧菌基因组DNA序列，结合生物信息学手段，确定以溶藻弧菌胶原酶（collagenase）基因保守区序列作为检测靶序列，设计合成了4条特异性的LAMP引物，对溶藻弧菌进行定性检测。 

本发明采用以下主要技术特征：

一种利用LAMP检测溶藻弧菌的引物组，由外引物对和内引物对组成，

所述的外引物对为：

F3： CCAGTGGCTTACTCGTTGG，

B3： TTCGCGGCCATAAACTCAT，

所述的内引物对为：

FIP： CGTTCCACTGCCCACCAAACAAGCCCAGCACTGGTATATGC，

BIP： GGCAACCAAACGGACCTTGCCCGATTGATGACGCCCTTAG。

本发明还具有如下特点：

一种利用LAMP检测溶藻弧菌的快速诊断试剂盒，它含有如上所述的引物组、阳性对照品、LAMP反应液和Bst DNA Polymerase聚合酶。

所述的引物中外引物对和内引物对的添加摩尔比为1:4。

所述的溶藻弧菌包括对溶藻弧菌标准菌株和溶藻弧菌分离菌株进行检测；

所述的LAMP反应体系为：

LAMP反应条件：65℃水浴作用45min。采用琼脂糖凝胶电泳法或浊度观察法进行检测结果的判定。

利用试剂盒法提取溶藻弧菌基因组DNA，以提取的溶藻弧菌基因组DNA作为LAMP反应阳性模板。采用单因子浓度梯度实验法逐一改变LAMP反应体系中各组分浓度，以优化LAMP反应体系，并调节反应温度和作用时间，建立了LAMP检测方法（见图1）。