[发明专利]一种检测H4N6型禽流感病毒的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种用纳米金颗粒检测H4N6型禽流感病毒DNA或RNA经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，属于生物检测技术领域。

背景技术

对基因（DNA）及其转录产物（RNA）的高灵敏性、高特异性、简单、快速的检测，对于疾病的早期诊断和治疗以及在在卫生防疫、环境监测、检验检疫等领域都具有十分重要的意义。以往在这方面较为准确灵敏的检测方法有荧光标记法、放射性标记等方法，这些方法都需要复杂的操作和特殊的设备，应用范围很窄。1993年PE公司的Dr. Kary B. Mullis发明了聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR。随后PCR技术大规模的应用于生物科研和临床治疗中，对DNA的检测进入了新的时代，Dr. Mullis为此还获得了1993年的诺贝尔化学奖。虽然PCR方法具有快速、灵敏、准确性高、操作较简单等优点，但由于其反应进行和产品DNA的检测需要特殊的仪器，PCR技术的使用一直被限定在专业的实验室和医院里。

2001年日本荣研化学株式会社研制出了一种新型DNA扩增方式，环介导等温核酸扩增技术（LAMP）可以在恒温条件下实现DNA的高效快速扩增，该方法反应条件简单，DNA扩增效率高，因此在核酸检测方面具有明显优势。但是对LAMP扩增制备的DNA产物使用常规的检测方法，如电泳法，荧光染料法等，均无法排除LAMP扩增所带来的假阳性问题，而且需要特殊的仪器，因此限制了LAMP技术的实际应用。

禽流感，全名鸟禽类流行性感冒，是由病毒引起的动物传染病，通常只感染鸟类，少见情况会感染猪。禽流感病毒高度针对特定物种，但在罕有情况下会跨越物种障碍感染人。自从1997年在香港发现人类也会感染禽流感之后，此病症引起全世界卫生组织的高度关注。其后，本病一直在亚洲区零星爆发，但在2003年12月开始，禽流感在东亚多国──主要在越南、韩国、泰国──严重爆发，并造成越南多名病人丧生。直到2005年中，疫症不但未有平息的迹象，而且还不断扩散。现时远至东欧多个国家亦有案例。

根据核蛋白的抗原性分类，禽流感病毒则属甲型流感病毒，甲型流感病毒是根据位于其套膜上的血凝素及神经氨酸酶的抗原性分为若干亚型，血凝素（H）有16个亚型；神经氨酸酶（N）有9个亚型。所有的这些亚型都可以感染鸟，在禽类中高致病性的属于H5、H7亚型。典型的鸡禽流感病毒是H7N7，造成1983年、1984年在美国东部大流行的是H5N2。目前东南亚地区出现的人类感染是H5N1型。1997年发现的H5N1型毒株被认定是当时流行性感冒的病源。1999年，香港出现过H9N2型禽流感的人类感染，2003年，荷兰出现过H7N7型禽流感的人类感染；2006年1月，美国出现H3N2。

H4N6型禽流感病毒的对人类的生活影响很大，但是目前针对H4N6型禽流感病毒缺乏简单、快速、便于使用和成本低廉的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提出一种用纳米金颗粒检测H4N6型禽流感病毒专有的基因片段经环介导等温核酸扩增技术扩增后产物DNA的试剂盒，从而判定H4N6型禽流感病毒的存在与否。

本发明采用如下采用下述技术方案来解决上述问题：本发明试剂盒包括两部分：（1）标记有可以识别H4N6型禽流感病毒特定序列的分子探针的纳米金颗粒；（2）可以扩增待检测样品中的H4N6型禽流感病毒DNA或先经过逆转录过程后再扩增待检测样品中的H4N6型禽流感病毒RNA的环介导等温核酸扩增体系。

本发明中，试剂盒的工作原理为：1．纳米金颗粒标记有能识别H4N6型禽流感病毒特定序列的分子探针，分子探针被固定在纳米金颗粒的表面。

2．待检测样品中的H4N6型禽流感病毒DNA分子或H4N6型禽流感病毒RNA经环介导等温核酸扩增技术大量复制或先经逆转录过程后大量复制，H4N6型禽流感病毒的目标片段被放大109倍，产生的扩增产物DNA具有多重重复序列。

3．混合纳米金颗粒和环介导等温核酸扩增体系，H4N6型禽流感病毒经环介导等温核酸扩增技术以后的产物DNA与纳米金颗粒上能识别H4N6型禽流感病毒特定序列的分子探针杂交。

4．纳米金颗粒沿环介导等温核酸扩增技术产物DNA分子链形成聚集体（如附图所示），进而引发纳米金颗粒聚集处（例如溶液中、固体表面等）的颜色变化，依据颜色变化可以判断待测样品是否具有H4N6型禽流感病毒DNA或RNA。

本发明中，纳米金颗粒探针包括两个部分，一是纳米尺度的金颗粒，另一部分是固定在纳米金颗粒表面的分子探针，该探针可以识别H4N6型禽流感病毒的特定序列。